A 型肉毒毒素對增生性瘢痕JNK 信號通路和成纖維細胞相關蛋白表達的影響

郭彩茹，李明鳴，牛宇杰

（1.鄭州大學附屬洛陽中心醫院 河南省腫瘤免疫與再生醫學國際聯合實驗室，河南 洛陽，471000；2.鄭州大學附屬洛陽中心醫院 燒傷整形科，河南 洛陽，471000）

增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）為纖維變性疾病，由創傷、燒傷等損傷真皮深層后纖維增殖紊亂所致[1-2]。相關數據報道，燒傷后HS發生率高達91%，手術后HS發生風險為40%～70%[3-4]。HS疼痛、瘙癢等癥狀極大影響日常生活，且嚴重者會并發局部潰爛或癌變，為患者帶來極大肉體損害、精神痛苦。有相關研究成纖維細胞為HS患者瘢痕形成的重要效應細胞，A型肉毒毒素（Botulinum toxin A，BTXA）可抑制、治療瘢痕增生[5]。進一步探討BTXA的作用機制，觀察BTXA對成纖維細胞內相關蛋白表達和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號變化的影響，分析BTXA對HS成纖維細胞增殖、凋亡的機制，可為HS患者的臨床生物學治療提供理論依據和實踐基礎。基于此，本研究選取人成纖維細胞，探討BTXA對HS成纖維細胞的抑制作用和分子機制。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經我院醫學倫理委員會審批通過，選取2021年10月我院HS患者手術標本，經病理組織學確診為HS；存在瘢痕凸出皮膚表面，癢、紅、痛等癥狀，處于增生活躍期；患者知情本研究并簽署知情承諾書。排除標準：取材前應用過青霉胺、類固醇激素等相關藥物；取材前有放射線治療史者；取材前有激光治療史者；合并感染性疾病者。

1.2 材料與方法

1.2.1 HS 成纖維細胞制備

將手術過程中獲得的組織標本置于無菌操作臺，使用手術剪去除皮下組織，保留帶表皮的瘢痕組織，將瘢痕組織剪成規格為1mm×1mm小組織塊，使用磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，加入3倍體積1mg/ml的I型膠原酶，37℃條件下振蕩水浴40-60min，加入3倍體積完全培養基（10%胎牛血清DMEM培養基）終止消化，1500r/min，離心5min后棄上清，用完全培養基重懸細胞，80um無菌濾網過濾，將無菌濾液加入培養瓶中放37℃，5%CO2培養箱內，4d后換液，后每間隔3d換液1次，約15d細胞基本融合，依據1：3比例傳代，培養3代后進行試驗。

1.2.2 CCK8 實驗檢測細胞增殖活力

分別取對數生長期細胞，調整細胞濃度為5×104/ml，接種至96孔版，100ul/孔，細胞貼壁后，分別加入濃度為0、1、2U、4U/ml BTXA，100ul/孔每組設3個復孔，細胞鋪板后2h，每孔加10μL CCK8試劑，3小時后酶標儀450nm處測定各組光密度（OD）值。每隔24小時按以上方法測一次OD值，繪制細胞增殖曲線。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取對數生長期細胞，調整密度為0.5×106/ml個，種植于6孔板中，每孔2ml。待細胞貼壁后，去除培養基，分別加入濃度為0、1、2U、4U/ml BTXA的完全培養基，2ml/孔，細胞貼壁后用消毒 1000μL移液槍頭均勻劃1條線，用 PBS洗細胞2次，去除漂浮細胞，顯微鏡下拍照記為0h，放于37℃，5% CO2培養箱培養，取24h，48h時間點于倒置顯微鏡下拍照，計算細胞遷移率。

1.2.4 細胞凋亡檢測

取對數生長期細胞，調整細胞濃度為2×105/ml，1ml/孔，接種至24孔版，培養24h后去除培養基，分別加入濃度為0、1、2、4U/ml BTXA的完全培養基，培養48h，參照活細胞Caspase-3活性與Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測操作，染色、固定，于顯微鏡下觀察。

1.2.5 熒光定量PCR 檢測成纖維相關蛋白基因變化

按照1.2.3方法進行藥物干預48小時后，消化細胞，使用Trizol（碧云天）從成纖維細胞中提取總RNA，測總RNA濃度。使用天根FastKing一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預混試劑逆轉錄cDNA（KR118），使用天根Super Real PreMix Plus（SYBR Green，FP205）試劑，使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR進行熒光定量PCR。引物合成自生工生物公司。引物序列：(1)CTGF：F:CTTGCGAAGCT GACCTGGAA,R:AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA(2)TGF1:F:GTACCTGAACCCGTGTTGCT,R:GAACCCGTTGATGTCCACTT(3)α-SMA:F:CTGCTGAGCGTGAGATTGTC,R:CTCAAGGGAG GATGAG GATG(4)JNK:F:GCTGGAATTATTCATCGGGAC、R:GATGA CCTCGGGTGCTCTG,(5)GAPDH:F:TGACTTCAACAGCGACACCCA-3R:GGAGGAGTGGGTGTCGC TGT

1.2.6 運用Western blot 法檢測BTXA 干預前后HS成纖維細胞中CTGF、α-SMA、TGF-β1、JNK 的蛋白表達

在H S 成纖維細胞中加入JNK 選擇性抑制劑SP600125，運用Western blot法檢測BTXA干預前后p-JNK的蛋白水平。簡要如下HS成纖維細胞，按照1.2.3描述的方法處理后，收取細胞后使用含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF的 RIPA高效細胞/組織裂解液（索萊寶）提取蛋白，并根據 BCA 蛋白檢測試劑盒的說明書測定蛋白濃度。待測蛋白用10%的SDS-PAGE凝膠電泳（60～80V），然后將目的蛋白在300mA、90min的條件下轉移至PVDF膜（PVDF，Millipore）。TBST溶液洗膜5min×3次；5%脫脂牛奶室溫封閉1h；一抗（1∶1 000稀釋）、GAPDH（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜后再用兔二抗（1∶1000稀釋）室溫孵育1 h。使用 BeyoECL plus 發光液（碧云天）發光并拍攝。

1.3 觀察指標

①BTXA對HS成纖維細胞增殖能力的影響，對比無BTXA干預和1、2、4U/ml BTXA干預后成纖維細胞增殖活力變化。③BTXA對HS成纖維細胞凋亡率的影響，對比無BTXA干預和1、2、4U/mlU/ml BTXA干預后成纖維細胞凋亡率。④成纖維細胞相關蛋白表達，對比BTXA干預前后TGF-β1CTGF、α-SMA、JNK表達。⑤JNK信號通路，對比JNK選擇性抑制SP600125干預前后磷酸化氨基末端激酶（p-JNK）表達。

1.4 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0對數據進行統計分析，計量資料正態分布以（）表示，組間比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BTXA 對HS 成纖維細胞活力的影響

CCK8實驗結果顯示，與無BTXA干預相比，1、2、4U/ml BTXA干預后48h，72h HS成纖維細胞增殖能力顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 BTXA 對HS 成纖維細胞增殖的影響（，%）

2.2 BTXA 對HS 成纖維細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗結果顯示與無BTXA干預相比，2U/ml、4U/ml BTXA干預后成纖維細胞遷移能力降低，劃痕愈合減慢（P＜0.05）。見圖2。

圖2 BTXA 對HS 成纖維細胞遷移的影響（×100）

2.3 BTXA 對HS 成纖維細胞凋亡率的影響

與無BTXA干預相比，2U/ml，4U/ml BTXA干預后HS成纖維細胞凋亡率增高（P＜0.05），紅色、綠色表示凋亡細胞，見圖3。

圖3 BTXA 對HS 成纖維細胞凋亡率的影響（×50）

2.4 成纖維細胞相關蛋白基因表達

熒光定量PCR結果表明，與BTXA干預前相比，BTXA干預后TGF-β1、α-SMA、CTGF基因表達均較低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 成纖維細胞相關蛋白基因表達（）

2.5 成纖維細胞相關蛋白表達

與BTXA干預前相比，BTXA干預后TGF-β1表達較低（P＜0.05）。見圖5

圖5 成纖維細胞相關蛋白表達

2.6 JNK 信號通路

與JNK選擇性抑制SP600125干預前相比，JNK選擇性抑制SP600125干預后p-JNK表達較高（P＜0.05）。見表1。

表1 JNK 信號通路（）

表1 JNK 信號通路（）

3 討論

HS為病理性瘢痕，在創傷6個月時增長速度，可發生在全身各個部位，HS組織學多表現為豐富纖維細胞、酸性粘多糖和排列規則Ⅲ型膠原，基底部多局限于原始損傷界限內，痛癢感明顯[6-7]。目前，臨床針對HS發生機制尚未做出全部闡述，但既往有研究報道HS發生與基因調控、細胞轉導通路、信號因子等相關，多因素共同作用調節成纖維細胞增殖、轉化、代謝、凋亡[8-9]。

成纖維細胞無法進入正常程序性死亡，會致使其異常增殖且細胞外基質過度沉積，在創傷修復晚期，依靠細胞凋亡組織改建，可改善凋亡機制，抑制HS形成。肉毒素為肉毒桿菌增殖過程中產生的細菌外毒素，依照肉毒素抗原性不同，可分為A、B、C1、C2、D、E、F、G八個類型，A型毒力最強[10-12]。BTXA為二硫鍵結合的重鏈和輕鏈組成的多肽鏈，能被蛋白酶裂解，可阻斷神經肌肉傳導，抑制神經傳遞介質，能抑制膠原分泌，延緩成纖維細胞增殖，誘導細胞凋亡[13-15]。研究結果表明，與無BTXA干預相比，1、2、4U/ml BTXA干預后HS成纖維細胞增殖能力較低、HS成纖維細胞凋亡率增高（P＜0.05）。近年來，臨床關于BTXA治療HS的研究主要集中在TGF-β1上，TGF-β1為HS發生、進展過程中重要促纖維化細胞因子，其高表達可激活細胞內信號，調控JNK信號通路，將細胞外刺激信號傳導至細胞內，激活相關細胞生物學反應，參與瘢痕增生[16-17]。α-SMA是肌成纖維細胞特征性標志物，是瘢痕組織具有收縮活性的結構基礎，可反映成纖維細胞向肌成纖維細胞轉分化受影響情況。CTGF是一種分子量為36～38kDa的多肽，在成纖維細胞中主要由TGF-β誘導產生，CTGF過度激活是纖維化疾病發生和HS發生進展的重要影響因素。與BTXA干預前相比，BTXA干預后TGF-β1、α-SMA、CTGF等基因水平和蛋白水平均降低（P＜0.05），表明BTXA可調控JNK信號轉導通路，抑制成纖維細胞相關蛋白基因和蛋白表達。此外，研究結果還顯示，與JNK選擇性抑制SP600125干預前相比，JNK選擇性抑制SP600125干預后p-JNK表達較高（P＜0.05）。JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）亞族，BTXA可依靠MAPK途徑調控細胞外基質增生，抑制信號傳導和MAPK介導的細胞系列反應，阻礙細胞生物學功能，抑制HS形成。同時BTXA能調控細胞內不同蛋白比值，調整細胞增殖基因表達，影響相關DNA合成，發揮抑制瘢痕形成作用。

綜上所述，BTXA可影響HS患者成纖維細胞增殖、遷移和凋亡，并能通過JNK信號通路誘導成纖維細胞凋亡，調控其相關蛋白表達，為臨床治療提供新靶點。本研究只初步探討了BTXA對HS患者JNK信號通路和成纖維細胞相關蛋白表達的影響，但瘢痕形成主要有炎癥期、纖維增生期、組織重建期，不同時期成纖維細胞活躍度存在差異，關于BTXA對不同時期HS形成的影響，有待日后進一步深入研究。