重金屬污染土壤植物修復中細胞分裂素的作用與機制

方治國,楊 青,謝俊婷,都韶婷

1 浙江工商大學環境科學與工程學院,杭州 310016 2 浙江樹人大學交叉科學研究院,杭州 310015

土壤是生態系統中物質與能量交換的重要場所,是人類賴以生存和發展的根本基礎,土壤環境中重金屬污染已受到各國科研人員的高度關注。重金屬具有高毒性、持久性、隱蔽性和難降解性,進入環境后不斷遷移,通過生物鏈富集作用直接或間接地危害人體健康[1]。目前,重金屬污染土壤的修復技術主要有物理修復、化學修復和生物修復等,在實踐過程中也逐漸開展了多種修復方式的聯合應用。植物修復因投資成本低、二次污染易控制、環境擾動少等優點受到研究學者的青睞[2]。強化植物修復效果的技術手段主要有水肥調控、菌劑接入、基因工程、螯合鈍化劑和土壤動物添加等,這些技術措施改變了植物的生長狀態、生化特征和抗性能力等,進而會影響植物修復的整體效果[3]。

植物內源激素是植物體內存在調節生長發育的低濃度小分子有機物,共分為七大類：細胞分裂素(cytokinin,CTK)、生長素 (auxin,IAA)、乙烯 (ethylene)、脫落酸 (abscisic acid,ABA)、赤霉素 (gibberellin,GA)、油菜素甾醇 (brassinosteroids,BR)及其它植物激素 (水楊酸、茉莉酸等)[4]。隨著科研人員對植物內源激素系統性研究的不斷深入,發現其在重金屬污染土壤植物修復中具有較強的應用潛力。近年來,IAA、ABA、GA等內源激素在植物修復中的應用及作用機理已開展了大量研究,但與CTK相關的研究內容與作用機制報道較少[5-7]。論文以CTK在調控植物生長發育及強化重金屬污染土壤植物修復中所取得的研究成果為基礎,重點整合了CTK對植物機體生理生化過程中的調控機理,系統論述了CTK對強化重金屬污染土壤植物修復中的作用與機制,并展望了CTK在植物修復中的研究方向。

1 細胞分裂素的種類與作用機制

1.1 細胞分裂素的概念和種類

1957年Skoog等[8]通過對鯡魚精子 DNA 樣本進行高壓滅菌純化出一種名為激動素 (kinetin,KT)的物質,用該物質對煙草 (Tobacco)愈傷組織進行體外培育發現可促進愈傷組織細胞分裂；1963年,Letham等[9]從玉米種子中提取出類似KT的物質,并發現該物質是一種天然存在高活性的細胞分裂刺激劑,最終命名為玉米素 (zeatin,ZT)。隨著科學研究不斷深入,Skoog等提出將所有與KT有相同作用的可促進植物細胞分裂、誘導葉芽形成、調控生長發育的化合物,統稱為細胞分裂素 (cytokinin,CTK)[10]。

目前,CTK主要分為自然存在和人工合成兩大類,天然細胞分裂素是在N6位具有類異戊二烯或芳香族側鏈的腺嘌呤衍生物[11],高等植物體內最豐富的類異戊二烯類CTK主要包括：異戊烯腺嘌呤 (isopentenyl adenine,iP)、順式玉米素 (cis-zeatin,cZ)、反式玉米素 (trans-zeatin,tZ)和二氫玉米素 (dihydrozeatin,DHZ)[10],而天然芳香族類CTK在植物體內含量較低,其中活性最高的CTK主要是6-芐基腺嘌呤 (6-Benzylaminopurine,6-BA)以及它的相關衍生物[12]。常見的人工合成CTK主要有KT、6-BA、ZT、四氫吡喃芐基腺嘌呤(tetrahydropyranyl benzyladenine,PBA)等[13],針對CTK對植物生長發育的作用機制與效果,人工合成的CTK外源物質在農業以及園藝方面有著廣泛的應用。

1.2 細胞分裂素在植物生長過程中的作用

CTK對于植物生長發育的調控作用主要包括：促進植物細胞分裂與分化、調節葉芽和根部生長、減輕頂端優勢、延緩葉片衰老、促進葉綠體發育等。研究表明,植物七大類內源激素的主要作用機制與影響效果雖各不相同,但對于植物生理過程的調控往往涉及多種激素的共同參與[14],其中CTK便與其他內源激素存在信號串擾與相互作用。例如：乙烯在植物體內調控衰老過程,誘導果實成熟,而Zdarska等[15]研究發現植物根部的乙烯通過信號傳遞調節CTK多步磷酸化正調節劑arabidopsisresponseregulator10 (ARR10)表達,激活了植物根部合成CTK,進而促進根尖分生組織 (root apical meristem,RAM)細胞分裂與發育,這表明乙烯與CTK彼此間的相互作用,調節著根部萌發與生長；ABA主要是一種引起植物幼芽休眠、葉片脫落、生長延緩等生理作用的內源激素,而在干旱條件下,CTK會與ABA產生拮抗作用,通過誘導葉片氣孔閉合,提高植物對干旱脅迫的耐受性[16]；GA在高羊茅 (Tallfescue)體內通過刺激蘗芽負調節基因teosintebranched1 (FaTB1)表達,抑制分蘗芽生長發育[17],而Zhuang等[18]通過外源施加10 μmol/L的CTK,發現蘗芽抑制作用得到緩解,分蘗芽長度顯著提升。以上結果皆表明CTK與內源激素間會通過信號傳導、協同與拮抗等作用共同調控植物生理活動[19]。

2 重金屬污染土壤植物修復中細胞分裂素的作用與機制

2.1 增強光合作用,延緩葉片衰老,提升植物抗性能力

植物體內葉綠體是CTK 作用的主要靶標之一,內源CTK激活葉綠體基因轉錄,外源CTK可提高葉綠體合成蛋白質水平,促進葉綠素合成酶的形成,增強植物光合作用[20]。Lu等[21]發現在擬南芥 (Arabidopsisthaliana)內源CTK應答基因cytokinin-responsivegata1 (CGA1)信號傳導的下游,硝酸鹽誘導的碳代謝基因GATA,nitrate-induciblecarbon-metabolism-involved(GNC)受到刺激并轉錄,CGA1和GNC作為葉綠體發生的兩個主要轉錄調節因子,彼此相互作用促進了葉綠體分裂與生長；同時Criado等[22]發現外源6-BA刺激小麥 (TriticumaestivumL.)葉綠體基質膨脹,促進葉綠素含量增加,抑制蛋白質在體內降解,顯著提高了葉片蛋白質和淀粉含量。內源CTK調節植物光合作用,而外源根部施加、葉面噴施CTK皆會促進體內葉綠素含量顯著上升,降低葉綠體損傷,增強植物光合作用能力[23]。

在葉片衰老初期,衰老啟動子senescence-associatedgene12 (SAG12)會被激活,促進異戊烯基轉移酶基因isopentenyltransferasegene(IPT)合成CTK[24],生成的CTK會促進體內與脂肪酸代謝相關的蛋白質,如：脂氧合酶、酰基載體等蛋白表達,清除葉面細胞的活性氧自由基,同時CTK還會促進氮轉運基因Ntransport-regulatedgene1.1 (TaNRTs1.1,TaNRT1.3,TaNRT1.4)表達,提高硝酸還原酶活性,減輕細胞膜氧化損傷[25—26]。同時,Liu等[27]采用0.01、0.1、1、10μmol/L的6-BA進行水稻 (OryzasativaL.)葉片培育,發現葉片衰老速度與濃度呈負相關,且6-BA下調了氨基酸代謝基因Osl20和Osh36、應激反應基因Osl43等SAGs代表性基因的轉錄水平,抑制了衰老基因表達,同時植物體內6-BA與茉莉酸調節葉綠素降解基因chlorophyll-degradation-relatedgenes(CDRGs)表達,彼此間通過拮抗作用,調控葉片衰老過程[28]。

因重金屬脅迫致使植物體內產生大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),引起植物代謝產物紊亂、脂質過氧化、酶活性降低、細胞膜損傷、細胞失活甚至死亡[29],此時植物激活抗氧化系統,通過釋放抗氧化物質抵御ROS損害。其中,Zhou等[30]在鎘和鋅復合污染條件下,對海濱錦葵 (Kosteletzkyapentacarpos)施加10 μM的t-ZR,顯著降低了丙二醛 (malondialdehyde,MDA)含量；Wang等[31]在砷 (As)污染土中種植0、0.1、0.5、1.5mg/L的KT浸泡后的玉米 (Maize)種子,收獲后測定發現超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)活性在0.5mg/L的處理組下提高50%,其后逐漸下降；在1.5mg/L處理時,體內過氧化物酶 (peroxidase,POD)、過氧化氫酶 (ctalase,CAT)活性提高約50%,體內As含量提高3倍。以上結果表明外源CTK能 提高SOD、POD、CAT 等抗氧化酶活性，增加抗壞血酸、脯氨酸、可溶性蛋白等非酶抗氧化劑含量,同時降低MDA、H2O2、超氧陰離子自由基 (O2-)等膜脂質過氧化指標,減輕ROS積累與損傷,提高重金屬脅迫抗性,這一作用保障了植物在重金屬脅迫下良好生長狀態,為重金屬污染土壤植物修復奠定了堅實基礎[32—33]。

2.2 調控根莖葉發育,增加植物生物量,強化植物富集效果

植物內源CTK主要在根部產生,其會抑制根部生長因子表達,并與IAA產生拮抗作用,負調控根部生長。一方面,當CTK與IAA比值在根部低時才會促進細胞增殖,根部器官主是由RAM分化而來[34],在RAM發育初期,首先CTK信號表達增強[35],在IAA接收信號后,會直接抑制A類CTK響應調節因子ARR7和ARR15表達,促進CTK負調節因子arabidopsishistidinephosphotransferprotein6 (AHP6)轉錄上升,其后CTK含量逐漸下降,與此同時IAA負調節蛋白shortpypocotyl2 (SHY2)活性被抑制,IAA外輸載體蛋白PIN-formed(PIN)表達上升,IAA合成逐漸上升[36]。其后,CTK又會通過B型ARR刺激SHY2信號表達,抑制PIN活性,阻礙IAA合成,因此,CTK與IAA二者主要通過信號傳遞以及拮抗作用,協調根部發育[37]。另一方面,內源CTK還會下調根部促生長因子stuntedplant1 (STP1)表達,Werner等[38]發現在擬南芥細胞分裂素氧化酶/脫氫酶cytokininoxidasesdehydrogenase(CKX)過表達的突變體中,CTK含量的降低導致STP1蛋白合成上升,根部生長顯著優于野生型,因此CTK對于植物根部生長發育往往起到負調控作用。

植物內源CTK通過與莖尖分生組織 (shoot apical meristem,SAM)相關基因的相互作用,調控植物SAM區域活性與大小。首先,在SAM中心與分生組織穩態和葉片發育有關的I類家族基因knotted1-likehomeobox(KNOX)轉錄因子會直接激活IPT基因[39],促進區域內CTK合成,促進SAM細胞分裂,Kurakawa等[40]發現在水稻SAM中當CTK激活酶基因LONELYGUY(LOG)表達后,會促進無活性的CTK轉化為具有生物活性的游離堿形式,致使CTK在特定發育域中被激活,進而直接提高SAM活性。其次,同源結構域轉錄因子WUSCHEL(WUS)是定義干細胞生態位的關鍵調節劑,并且WUS是誘導SAM增殖分化的直接媒介[41],CTK通過B型ARR激活SAM中WUS的轉錄,刺激分生組織啟動與發育[42]。同時,Chatfield等[43]發現在擬南芥ARR7和ARR15過表達突變體內CTK含量顯著下降,與野生型相比SAM細胞活性、莖部發育都受到顯著抑制,由此表明CTK在莖尖分生組織局部激活、分裂分化、活性提高等方面發揮著關鍵作用。

植物富集是利用植物根系從土壤中吸收重金屬并將其轉移到可收獲的地上部分,并且可從植物的可收獲部分中回收金屬,但如今許多超級累植物如印度薺菜 (Brassicajuncea)、擬南芥、東南景天 (Sedumalfrediihance)、天藍遏蘭菜 (ThlaspicaerulescensL.)等自身生物量較小[44],且多數植物在生長過程中存在一定程度的頂端優勢,抑制了側枝發育[45],這更加減小了重金屬蓄積空間,導致植物修復效果難以達到預期要求。外源CTK的應用可減輕植物頂端優勢,促進葉片和側芽細胞的分裂,增加植物生物量,擴大重金屬蓄積體,增強重金屬富集效果。Luo等[46]通過對桉樹 (Eucalyptusglobulus)進行葉片噴施20 mg/kg的商業產品CTK,發現實驗組整株生物量與對照相比增長了39.1%,同時Thomas[47]等在銅 (Cu)脅迫下,發現在CTK過表達煙草中生物量顯著增加,成熟葉片中Cu富集量提高8倍。其實在植物莖葉部位,當CTK與IAA比值高時,會促進頂端以下腋芽枝條發育[48],此時外源CTK會轉化為內源t-ZR、IP,而內源CTK的B型ARR信號因子會直接激活CTK受體蛋白組氨酸蛋白激酶arabidopsishistidinekinase4 (AHK4)、CKX4/5、WUS等基因表達,進而促進葉片幼芽細胞分裂增殖[49]。植物體內CTK對于根莖葉發育起到的基礎調控作用,為外源CTK應用增加植物生物量提供理論支持,因此CTK能夠通過擴大重金屬植物蓄積體進而提高重金屬富集量[49]。

2.3 增強轉運蛋白表達,提高葉面蒸騰作用,促進重金屬吸收轉運

重金屬在植物體內的轉運過程直接影響著根部對重金屬的吸收程度,轉運蛋白是植物體內一類膜蛋白,可實現跨膜轉運養分、代謝產物、有毒污染物等生物分子,轉運蛋白對植物營養吸收、生長發育、體內穩態和脅迫反應至關重要[50]。CTK通過影響部分轉運蛋白的表達,調控植物對于重金屬的吸收與轉運。研究表明,擬南芥對砷 (As)的吸收量與體內磷酸鹽轉運蛋白phosphatetransporter1;1 (PHT1;1)的表達密切相關[51],Castrillo等[51—52]在As脅迫下通過對擬南芥進行qRT-PCR分析發現,當體內CKX1基因過表達時,體內PHT1;1表達被抑制了2.7倍,且體內As含量與對照組相比顯著下降；Jiang等[53]發現擬南芥功能缺失突變體ipt 1 3 5 7體內硒 (Se)含量降低47.8%,而受體缺失突變體AHK2和AHK3 體內Se含量增加35.4%、24.1%,由于亞硒酸鹽被植物中的磷酸鹽 (Pi)轉運蛋白吸收[54],通過對比分析發現ipt 1 3 5 7體內PHT1;1、PHT1;8轉錄分別降低了57.4%、62.7%,而突變體AHK2、AHK3 體內PHT1;1轉錄提高1.22、1.11倍,PHT1;8轉錄增加0.86、0.76倍,PHT1;9增加0.69和0.50倍,這些結果表明內源性CTK可通過促進轉運蛋白的表達,促進植物對污染物的吸收和積累。其實,在植物機體內也存在著與重金屬排毒有關的轉運蛋白,這些轉運家族主要包括：ATP結合盒式蛋白ATP-bindingcassette(ABC)、金屬耐受蛋白metaltoleranceprotein(MTP)、多藥及有毒化合物外排蛋白multidrugandtoxinextrusion(MATE)、鋅鐵調控轉運蛋白ZRT and IRT-likeprotein(ZIP)等[55-57],能夠調控根部對重金屬的吸收,協調機體內部重金屬的轉運,維持著胞內胞外毒物的平衡。目前,CTK與各類轉運蛋白相關性研究報道較少,其作用機制仍需進一步探索和研究。

植物葉面氣孔影響著植物蒸騰作用,外源CTK可通過調控葉表皮氣孔細胞活動,增強蒸騰作用[58],促進重金屬吸收。一方面,CTK與氣孔發育關鍵轉錄因子speechless(SPCH)相互作用,調節氣孔發育的起始,同時CTK通過A型ARR16、ARR17信號調控氣孔譜系細胞的分裂,增加氣孔數量[59]；另一方面,植物自身通過促進ZjPYR1、SmGRP1等基因的表達,增強氣孔細胞對ABA的敏感性,抑制葉片氣孔開放[60-62],而CTK通過B型ARR1,11,12等抑制ABA正調節因子蔗糖非發酵-1相關蛋白激酶基因sucrosenon-fermenting-1-relatedproteinkinase2 (SnPK2)活性,與ABA產生拮抗作用,進而促進氣孔開放[63],同時Marchadier等[64]通過對擬南芥外源施加6-BA,發現降低了氣孔細胞對于ABA的敏感程度,延緩氣孔閉合,提高蒸騰作用。研究表明,植物蒸騰作用產生的向上作用力,影響著根部對可溶性污染物的吸收程度,且蒸騰強度與植物吸收呈正相關[65—66],這意味著CTK能夠通過正調節植物蒸騰作用,促進植物對于重金屬的吸收。然而,Arnaud等[67]對擬南芥野生型和突變體AHK3外源施加0.01—10μmol/L的t-Z,發現野生型隨著濃度的上升,孔徑逐漸減小,而AHK3缺失突變體孔徑沒有顯著變化,這表明外源t-Z通過與AHK3作用誘導氣孔關閉,抑制了蒸騰作用。因此,內源CTK調控植物氣孔細胞分裂,提高氣孔密度,同時促進氣孔開放,增強了蒸騰作用,促進了植物對于重金屬的吸收。然而,外源CTK的應用所產生的作用,則與種類、濃度、植物特性等有較大關系[68]。同時,目前針對CTK與蒸騰作用以及植物修復之間的相關性研究還較少,彼此間的相互影響與關聯機制仍需進一步研究。

2.4 參與解毒過程,降低重金屬毒性,調控重金屬體內轉化

金屬離子進入植物體內,會改變植物細胞現有的動力學和氧化還原系統,并對植物細胞膜、葉綠體、細胞核等產生毒性和損傷[69],而CTK信號會被激活并且參與植物體內自身解毒過程,植物自身會釋放谷胱甘肽 (glutathione,GSH)、植物螯合素 (phytochelatins,PCs)、半胱氨酸 (cysteine,Cys)等非蛋白巰基,與重金屬發生絡合反應,將毒性更低的絡合物儲存在液泡中,降低重金屬離子的遷移[70]。Mohan等[52]發現,在As脅迫下,通過對比研究CKX1基因突變體和野生型擬南芥體內PCs合成基因表達情況,發現突變體內部CTK含量下降,同時phytochelatinsynthase1 (PCS1)、glutathionesynthetase2 (GSH2)、γ-glutamylcysteinesynthetase(γ-ECS)等PCs合成基因的表達下降。Singh等[71]在Cd脅迫下對茄子 (SolanummelongenaL.)幼苗噴施10μM的KT,發現KT處理組與對照相比,體內非蛋白巰基含量提高了26%,這說明外源施加CTK能促進體內非蛋白硫醇的合成。Cassina等[72]在鎳 (Ni)脅迫下,通過對超富集植物庭薺 (Alyssummurale)進行葉片和根部施加CTK,測定發現CTK并未使體內Ni積累量及硫醇濃度發生顯著增加。這意味著CTK調控植物體內非蛋白巰基基因表達,調控解毒物質合成,參與植物體內重金屬的解毒機制，但作用效果的強弱與濃度有一定關系[73]。

植物體內金屬硫蛋白是富含半胱氨酸的金屬結合蛋白,維持金屬穩態和應激反應,也是清除植物體內活性氧自由基的重要物質,在植物遭受重金屬脅迫時可減輕毒性[74]。Yuan等[75]通過外源施加6-BA、t-Z和KT影響了水稻根部初期發育時金屬硫蛋白metallothionein2b(OsMT2b)基因的表達；Thomas等[47]在Cu脅迫下以IPT轉基因與非轉基因煙草為實驗對象,對比分析了兩者體內金屬硫蛋白metallothionein-likegene2 (MT-L2)基因表達水平,發現對照組煙草體內MT-L2 mRNAs轉錄水平顯著下降,而實驗組中由于IPT的過表達促進了CTK生物合成,在轉基因煙草體內檢測到MT-L2轉錄水平上升,同時在成熟葉片中Cu積累量增長了8倍。由此可見,內源CTK調控體內硫蛋白基因表達,而外源CTK施用則會影響體內金屬硫蛋白含量,參與重金屬解毒過程,提高植物對于重金屬的積累。目前,有關CTK與多種金屬硫蛋白家族相關基因如：AsMT、PoMT、HcMT、SpMT2等的作用機制研究還不夠充分深入[76],仍需要進一步加強。

3 總結與展望

論文綜述了植物內源激素CTK在調控植物生長發育及強化重金屬污染土壤植物修復中的作用,明確了在植物修復中外源CTK能夠有效促進植物生長、調節光合作用、促進重金屬轉運、強化抗性系統等 (圖1)。總體而言,低濃度CTK的應用能促進植物生長發育并強化植物修復效果,而高濃度CTK會對植物生長產生不利的影響。CTK作為植物外源激素已在農作物生產中廣泛應用,它可顯著提高農作物抗鹽、抗旱等抗脅迫能力,且人工合成CTK具有價格低廉、種類廣泛、應用便捷等特點,因此在重金屬污染土壤植物修復中具有良好的應用前景。目前,CTK在植物修復中的應用還存在不足之處,將來可以從以下方面開展深入研究：

圖1 細胞分裂素在重金屬污染土壤植物修復過程中的作用機制Fig.1 The mechanism of cytokinin in the process of heavy metal phytoremediation

(1)完善CTK對重金屬污染土壤植物修復的作用機制。目前多數研究側重于CTK對植物生長過程的調控作用,忽略了CTK在植物修復過程中作用機理的研究。在植物修復中,植物揮發機理是通過將汞、砷、硒等重金屬吸收至體內再經內部轉化釋放到大氣中,內源CTK對體內金屬離子轉化的調控機制及外源CTK的應用是否會影響植物揮發的作用過程,目前都不得而知；在植物根際降解機制中,內源CTK對根系分泌物檸檬酸、蘋果酸、草酸等產生是否具有調控作用,外源CTK的施加是否會影響植物根系對重金屬的降解效果及相關的作用機制,目前都還缺乏確切的解釋。因此,應加強CTK對植物修復機理影響作用的研究,為CTK在重金屬污染土壤植物修復中的應用提供更為完整的理論依據。

(2)重點關注CTK對土壤結構、性質、酶活、微生物群落等的影響作用,總體把控CTK對污染土壤植物修復系統產生的效應。土壤中有機質、氮磷鉀含量、pH等決定著植物營養元素的供給情況；土壤酶活性則是反映土壤質量和肥力的重要生物指標；而植物根系與土壤微生物構成的聯合修復體系影響著植物對重金屬的吸收積累。但目前的研究重點仍是CTK對植物地上部產生的影響作用,忽略了CTK對于土壤根系及微生物的研究。因此,應深入研究CTK對土壤生態系統的影響機制,探索CTK對于植物-土壤聯合系統的作用。

(3)拓展CTK聯合超級累植物在實際修復工程中的應用,明確CTK對不同植物修復的強化效果。一方面,工程項目中實施條件復雜,難以控制,這將導致CTK在實際應用時的降解速度、轉化程度、強化效果的等均有改變。另一方面,采用超級累植物作為蓄積體進行修復應用較為廣泛,但目前對超級累植物聯合CTK進行修復的研究較少,且不同植物適用的CTK互不相同。因此,應將CTK聯合植物修復技術應用于實際工程項目中,根據應用效果不斷完善適應植物修復的外源CTK種類、施加濃度以及施加方式等因子。

(4)明確重金屬脅迫下外源CTK的應用對內源激素信號系統的作用機制。內源激素對于植物生長發育具有不可替代的作用,彼此間可通過代謝轉化、協同拮抗、彼此調控等作用調節激素合成及植物生理活動,在誘導植物對生物及非生物脅迫的耐受性中發揮著重要作用。因此,明確重金屬脅迫下CTK與各激素間的因子響應、基因轉錄、信號傳遞等過程,對深層次掌握CTK在植物修復中的作用有著重要意義。