rs66593747基因型對矮小癥患兒Cor IGF-1水平及rhGH療效的影響

王嫣嫣 王曉萌 盧軍見

矮小癥在中小學生群體中發病率達3%，治愈率卻低于1%[1-2]。研究[3-4]發現，矮小癥發生與生長激素分泌不足與缺乏、骨骼發育異常等因素有關。研究[5-6]發現，內質網應激可以經由調節軟骨細胞、成骨細胞以及破骨細胞等生長發育介導骨相關疾病發生與進展，而7號染色體上人類同源物(BBF2 human homolog on chromosome 7，BBF2H7)基因與機體內質網應激關系密切。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)為調節生長發育重要激素之一，與矮小癥發生以及病情進展關系密切[7]。皮質醇(cortisol，Cor)可經由抑制胰島素樣生長因子結合蛋白-2降解抑制機體IGF-1，影響機體生長發育[8]。重組人生長激素(recombinant human growth hormone，rhGH)為矮小癥常用治療藥物，促進矮小癥兒童身體生長發育[9]。本研究旨在探究BBF2H7基因rs66593747位點基因型對矮小癥患兒血清Cor、IGF-1水平及rhGH療效影響，為矮小癥患兒遺傳發病原因研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年12月至2020年7月頂山市第一人民醫院和鄭州市兒童醫院收治的93例矮小癥患兒以及同期在平頂山市第一人民醫院和鄭州市兒童醫院進行體檢的35例健康兒童分別作為研究組與對照組。研究組男性56例，女性37例；年齡4～12歲，平均(8.15±1.76)歲。對照組男性24例，女性11例；年齡3～13歲，平均(8.92±1.64)歲。兩組對象一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具可比性。

研究組納入標準：①符合第7版《諸福棠實用兒科學》矮小癥診斷標準[10]；②血脂以及血常規檢查結果正常；③甲狀腺功能以及智力正常；④在入組前患兒未接受治療或者近期未服用外源性維生素D、腎上腺皮質激素等治療；⑤研究對象家屬同意參與研究，符合《赫爾辛基宣言》中倫理學要求。對照組納入標準：發育及心理狀況正常，研究對象家屬同意參與研究，符合《赫爾辛基宣言》中倫理學要求。兩組對象排除標準：①肝腎功能損傷者，存在中樞神經系統疾病或者營養不良、肥胖、糖尿病等情況者；②繼發因素所致的生長激素分泌障礙；③存在遺傳代謝疾病、甲狀腺功能異常、骨骼發育異常者。

1.2 方法

1.2.1 rs66593747位點基因型檢測 研究組在進行治療前、對照組在體檢當日采集肘靜脈血3 mL，以10 000 r/min轉速進行1 min離心，收集上清液，應用RNA提取試劑盒進行總RNA抽提，隨后應用逆轉錄試劑盒逆轉錄獲得cDNA。基因型應用聚合酶鏈反應進行檢測，選擇β-actin作為模板，將引物、SYBR Green染料、dNTP加入反應體系中使其體積達20 μL，反應條件設置：93℃、93℃、55℃條件下分別處理2 min、1 min、2 min， 40個循環。基因檢測引物與試劑盒購自上海賽默飛世爾科技有限公司，rs66593747位點：上游5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，下游5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’；內參基因GAPDH：上游5’-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3’，下游5’-AAATGAGCCCCAGCCTTC TC-3’。

1.2.2 血清Cor與IGF-1水平測定 研究組在治療前、對照組在體檢當日采集肘靜脈血3 mL以4 000 r/min速度離心處理10 min后取上清液，血清Cor與IGF-1水平分別應用免疫化學發光法與酶聯免疫吸附法進行測定，測定按照試劑盒說明書進行操作。試劑盒購自廈門市波生生物技術有限公司與羅氏生物科技有限公司。

1.2.3 rhGH治療 研究組對象進行營養支持治療，保持充足睡眠，同時補充一定量的維生素B12以及鈣，口服司坦唑醇(廣西南寧百會藥業集團有限公司，國藥準字H45020728，規格：2 mg×12片×2板)，睡前0.5～1.0 h在臀部外上限或者腹部臍周位置皮下注射rhGH(長春金賽藥業股份有限公司，國藥準字S10980101，規格：每瓶4.5 IU/1.7 mg/1.0 mL)，注射劑量為30 μg/(kg·d)，頻率為1次/天，6個月為1個周期，共2個周期。療效評價[11]：依據患兒身高增長情況評估患兒治療療效，有效為經過治療后身高增長超過3 cm，無效為患兒經過治療后身高增長不足3 cm。

2 結果

2.1 兩組對象rs66593747位點哈德溫伯格平衡檢驗比較 研究組與對照組對象rs66593747位點AA、AT、TT基因型觀察值與期望值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，符合哈德溫伯格平衡。見表1。

表1 兩組對象rs66593747位點哈德溫伯格平衡檢驗比較

2.2 兩組對象rs66593747位點基因型、血清Cor與IGF-1水平比較 研究組對象rs66593747位點AT基因型頻率、血清IGF-1水平低于對照組(P<0.05)，rs66593747位點TT基因型頻率、血清Cor水平高于對照組(P<0.05)，兩組對象rs66593747位點AA基因型頻率以及A、T等位基因頻率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組對象rs66593747位點基因型、血清Cor與IGF-1水平比較

2.3 rs66593747位點基因型、血清Cor、IGF-1水平與矮小癥發生多元logistic回歸分析 以矮小癥發生為因變量(Y=矮小癥；是=1，否=0)，以研究組與對照組rs66593747位點基因型(X1=rs66593747位點基因型；1=AA，2=AT，3=TT)，及血清Cor(X2=Cor水平)、IGF-1(X3=IGF-1水平)水平比較存在統計學差異的指標為自變量進行多元logistic回歸分析，以輸入方式篩選變量，納入3個自變量均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 rs66593747位點基因型、血清Cor、IGF-1水平與矮小癥發生多元logistic回歸分析

2.4 不同rs66593747位點基因型患兒血清Cor、IGF-1水平比較 AT型患兒血清Cor水平低于TT型與AA型，IGF-1水平高于TT型與AA型(P<0.05)；TT型與AA型基因患兒血清Cor、IGF-1水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同rs66593747位點基因型患兒血清Cor、IGF-1水平比較

2.5 不同rhGH治療療效患兒rs66593747位點基因型、血清Cor及IGF-1水平比較 93例患兒采用rhGH治療后有效72例(有效組)，無效21例(無效組)。有效組患兒AT基因型頻率與IGF-1水平高于無效組，Cor水平低于無效組(P<0.05)，有效組與無效組患兒TT、AA基因型頻率及T、A等位基因頻率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 不同rhGH治療療效患兒rs66593747位點基因型、血清Cor及IGF-1水平比較

2.6 患兒rs66593747位點基因型與血清Cor、IGF-1水平、rhGH治療療效相關性分析 Spearman相關性分析顯示，rs66593747位點基因型與血清Cor負相關、與IGF-1正相關、與rhGH治療療效無相關性(r=-0.354，P<0.001；r=0.312，P<0.001；r=0.062，P=0.554)。見圖1～3。

圖1 rs66593747位點基因型與血清Cor水平相關性箱式圖

圖2 rs66593747位點基因型與血清IGF-1水平相關性箱式圖

圖3 rs66593747位點基因型與rhGH治療療效相關性箱式圖

3 討論

生長激素(growth hormone，GH)/IGF-1軸及其他相關信號通路介導機體生長發育，相關基因遺傳缺陷，造成矮小癥發生，其中內質網應激可以通過介導骨代謝平衡影響機體生長發育[12-13]。BBF2H7基因為內質網應激傳感器，可由對應通路促進軟骨基質蛋白釋放以及軟骨細胞增殖，介導機體生長發育，而rs66593747位點處于BBF2H7基因上，可能在機體生長發育中發揮重要作用[14]。本研究結果顯示，研究組與對照組rs66593747位點AT以及TT基因型頻率存在差異，可能與矮小癥發生有關。但多因素回歸分析顯示AT、TT基因型并不是矮小癥發生影響因素，rs66593747位點可能并不直接影響矮小癥發生，或經其他途徑介導矮小癥發生。

Cor水平過高表明機體蛋白質以及脂肪分解速度加快，導致機體蛋白質儲備不足，使機體生長發育受到影響[15-16]。IGF-1反映了GH自主分泌情況，可以促進機體蛋白質形成以及骨骼發育，IGF-1水平低反映了機體對于蛋白質形成、骨骼發育調節作用不足，影響機體生長發育[17-18]。本研究結果顯示，相對于TT型與AA型患兒，AT型基因患兒血清Cor水平較低，IGF-1水平較高，表明rs66593747位點基因型可能經由調節下游細胞因子水平而影響矮小癥發生。國內研究[19]發現，rs66593747位點GT基因型IGF-1水平顯著高于GG型與TT型，但是該研究認為rs66593747位點作為內質網應激途徑中重要成員，介導分泌蛋白以及膜蛋白分泌，調節鈣磷平衡，介導機體生長發育。相關性分析顯示，rs66593747位點基因型與患者血清水平Cor水平、IGF-1水平存在相關性，筆者推測，rs66593747位點基因型通過上調機體IGF-1水平，抑制Cor表達，間接影響機體生長發育。

rhGH為人工合成生長激素，可發揮與天然生長激素相同生物學作用[20]。本研究結果顯示，有效組患兒AT基因型頻率與IGF-1水平明顯高于無效組，Cor水平明顯低于無效組，顯示rs66593747位點AT基因型療效相對較好。分析認為，rs66593747位點AT基因型可以上調機體IGF-1水平，抑制Cor表達。謝坤霞等[14]研究也顯示，rs66593747位點基因型與rhGH治療療效有關，但rhGH治療療效與GT基因型相關性最高，這可能與不同地區、不同種族有關。雖然本研究中有效組與無效組患者rs66593747位點AT基因型頻率比較差異存在統計學意義，但相關性分析結果顯示兩者不相關，這可能與rs66593747位點基因型對于矮小癥發生影響一致、rs66593747位點基因型并不直接影響患者治療效果等有關。

綜上所述，rs66593747位點基因型與矮小癥患者血清Cor、IGF-1水平關系密切，但是不會影響rhGH治療療效，可以為患者病情評估以及療效預測提供參考。