牛奶蛋白過敏患兒維生素D代謝酶和其受體水平

李傳應 吳 成

牛奶蛋白過敏(cow’s milk protein allergy, CMPA)是由牛奶蛋白引起的一種變態反應，多見于嬰幼兒[1]。CMPA可影響全身多個系統，并以消化系統癥狀和皮膚癥狀為主要表現[1-2]。CMPA若沒有得到及時、正確的診斷和治療，可導致遷延性腹瀉、嘔吐、食欲低下，引起患兒生長發育障礙、缺鐵性貧血、低蛋白血癥等危害，嚴重影響患兒生活質量[1-3]。

維生素D是一種脂溶性維生素，可以促進皮膚細胞生長、分化及調節機體免疫功能[4]。維生素D代謝物25 羥維生素D [25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D]在CMPA患者體內水平顯著降低[5]，前期研究[3]也發現維生素 D 聯合游離氨基酸治療CMPA 患兒效果優于單一游離氨基酸 。維生素D生物學效應主要是通過其受體(vitamin D receptor, VDR)發揮[4]。此外，維生素D在機體內活化以及代謝滅活過程受多種代謝酶的影響[6]。CMPA中25(OH)D水平低下和生物學功能異常是否與上述調控因素有關尚未明確。本研究旨在明確CMPA中VDR和維生素D代謝酶水平變化，研究其與CMPA病情程度聯系為臨床CMPA診斷和治療提供潛在的生物學靶點，也為進一步揭示CMPA發病機理提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安徽省兒童醫院2018年5月至2020年5月診治的32例CMPA患兒為研究對象(試驗組)，其中男性13例，女性19 例；月齡2～5個月。根據其過敏癥狀輕重程度，將試驗組患兒分為輕中度組(20例)和重度組(12例)。CMPA判斷標準[7]：輕度具有以下一種癥狀，①嘔吐、便秘、便血、腹瀉等胃腸道反應；②慢性咳嗽、非感染性流涕及喘息等呼吸系統表現；③皮膚出現紅斑、血管性水腫、濕疹樣表現等；④持續腸痙攣≥3 h/d，≥3次/周，持續≥3周。中度具有上述胃腸道反應、呼吸系統、皮膚等多種表現。重度為上述表現加重，且出現嚴重過敏反應、呼吸困難、血壓下降等。此外選取同期于本院進行健康體檢的17例健康嬰幼兒作為對照組，其中男性5例，女性12例，月齡2～6個月。

試驗組和對照組對象性別構成、月齡、體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05) ，具有可比性。見表1。輕中度組和重度組患兒性別構成、幼兒月齡、喂養方式及體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05) ，具有可比性。見表2。試驗組和對照組對象均進行常規性維生素D補充(伊可新，每粒含維生素D3 500 IU)，1次1粒，1天1次。兩組嬰幼兒均無黃疸，也未行光照療法。試驗組和對照組資料和樣本獲取均獲得知情同意。本研究已獲安徽省兒童醫院醫學倫理委員會批準(倫理批文號：EYLL-2019-029)。

表1 試驗組和對照組對象一般資料對比

表2 輕中度組和重度組患兒一般資料對比

納入標準：①患兒符合中華醫學會2013版《中國嬰幼兒牛奶蛋白過敏診治循證建議》[7]CMPA 診斷標準；②患兒無先天性疾病；③患兒均為牛奶人工喂養的正常足月兒；④患兒親屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準: ①患兒在確診CMPA前2周內有抗組胺使用史; ② 伴有細菌或者病毒感染者；③合并高鈣血癥、高磷血癥、維生素D增多癥等其他影響維生素D水平的疾病；④合并自身免疫缺陷性疾病的嬰幼兒。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測25(OH)D水平 試驗組和對照組對象在被納入研究后清晨空腹收集肘靜脈血2 mL置于EP管內，常溫靜置后，離心分離出血清，-80℃保存待測。酶聯免疫吸附法(enzyme linked immumosorbent assay，ELISA)檢測血清25(OH)D水平，ELISA試劑盒由上海將來實業股份有限公司提供。

1.2.2 聚合酶鏈式反應檢測VDR、CYP24A1、CYP27B1基因水平 試驗組和對照組對象在被納入研究后，空腹收集肘靜脈血2 mL，置于離心管中，密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，加入2 mL含10%胎牛血清DMEM培養液，重懸細胞，細胞計數。采用Trizol試劑(TaKaRa大連寶生物)提取細胞中總RNA，后反轉錄為cDNA，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)對細胞中VDR、CYP24A1、CYP27B1基因水平進行檢測。以三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內參基因, 用2-ΔΔCT法分析相對表達量。

2 結果

2.1 試驗組和對照組實驗室指標比較 試驗組血清25(OH)D水平低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05); 試驗組CYP24A1 mRNA相對表達量試驗組高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。VDR mRNA和CYP27B1 mRNA相對表達量兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 試驗組和對照組25(OH)D及其受體、代謝酶指標比較

2.2 輕中度組和重度組患兒實驗室指標比較 輕中度組血清25(OH)D水平低于重度組，差異具有統計學意義(P<0.05)；輕中度組CYP24A1 mRNA水平低于重度組，差異具有統計學意義(P<0.05)。VDR mRNA和CYP27B1 mRNA相對表達量兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 輕中度組和重度組25(OH)D及其受體、代謝酶指標比較

2.3 相關性分析 CMPA患者血清25(OH)D水平與住院天數呈負相關(r=-0.470,P=0.007), CYP24A1 mRNA相對表達量與住院天數呈正相關(r=0.806,P<0.001)，25(OH)D水平與CYP24A1 mRNA相對表達量呈負相關(r=-0.397,P=0.024)。見圖1。

圖1 CMPA患兒25(OH)D、CYP24A1mRNA、住院天數3者之間相關性分析

3 討論

維生素D可調控細胞增殖、分化和改變其他細胞生物學活性，發揮免疫調節、改善糖代謝、調控腎素血管緊張素水平等多種生物學效應[4]。維生素D參與嬰幼兒多種疾病病理過程[8]。研究[9-10]發現，過敏性哮喘兒童血清中的維生素D代謝物水平低于正常兒童，外源性補充維生素D能有效預防過敏性哮喘發生。也有研究[11]發現，患兒體內25(OH)D水平與過敏性癥狀持續時間具有密切的聯系，其中25(OH)D水平越低，過敏癥狀持續時間越長。本研究發現，試驗組患兒外周血25(OH)D水平低于對照組，輕中度組患兒的25(OH)D水平明顯高于重度組患兒，提示維生素D活性代謝物可能參與CMPA病理進展過程。一般認為25(OH)D活性代謝物1,25(OH)2D通過與VDR結合發揮生物學效應[4]。因為VDR廣泛表達于機體組織和細胞中[12]，為了進一步探討CMPA中維生素D活性代謝物生物學功能異常是否與VDR水平變化具有一定的聯系，本研究初步考察患兒外周血VDR水平變化。筆者發現，試驗組患兒VDR基因表達水平與對照組相比無明顯差異，且輕中度組患兒VDR基因表達水平與重度組患兒相比也無明顯差異，提示25(OH)D可能是通過自身水平變化來參與和影響CMPA進程。

維生素D沒有活性，在體內經2次羥基化生物代謝轉化為活性代謝物發揮生物活性。維生素D運輸到肝臟中經25-羥化酶CYP27A1作用, 可生成25(OH)D。隨后，在CYP27B1 1-α 羥化酶催化下，25(OH)D轉化為活性1,25(OH)2D。CYP24A1可催化1,25(OH)2D和25(OH)D生成無活性24位羥維生素D排除體外[6]。樹突狀細胞和淋巴細胞在內的多種免疫細胞均大量表達CYP27B1和CYP24A1[13-14]。25(OH)D是維生素D代謝物在體內最主要的存在形式，為進一步探討CMPA中25(OH)D水平低下是否與維生素D代謝酶有關，并且初步考察25(OH)D相關代謝酶水平是否與CMPA疾病進程存在聯系，本研究考察了維生素D體內活化和失活主要代謝酶CYP27B1、CYP24A1在PBMC中表達變化情況，研究結果表明試驗組患兒外周血CYP24A1水平高于對照組，輕中度組患兒CYP24A1水平低于重度組患兒。然而本研究未發現CYP27B1在上述各組之間有差異，提示CMPA狀態下異常高水平CYP24A1加速了25(OH)D代謝失活，抑制了維生素D活性代謝物對機體過敏反應的保護作用。早先研究[15]發現，免疫細胞CYP24A1受到炎癥和免疫反應調控，在炎癥因素刺激下，CYP24A1轉錄水平可顯著增加，這與本研究結果相一致，即CMPA中免疫失調導致CYP24A1水平增高，加速25(OH)D生物代謝，從而抑制25(OH)D的抗炎和抗過敏作用的發揮。

綜上所述，CMPA患兒外周血25(OH)D水平降低與CYP24A1水平升高有關。25(OH)D和CYP24A1水平與過敏癥狀嚴重程度存在一定的聯系，提示CYP24A1可能是CMPA潛在的治療靶點。