哈茨木霉和葡萄座腔菌對亞甲基藍染料的脫色試驗初報

魏鴻錦，吳林應(yīng)，尚曉靜，侯 瑞

（貴州大學，貴州貴陽 550025）

亞甲基藍（Methylene blue）是一種噻嗪類染料，已被廣泛應(yīng)用于紡織品和紙張的染色。其污水已被證實可引發(fā)多種疾病，如休克、黃疸、組織壞死、嘔吐、眼灼傷、惡心、頭暈等[1]。因此，如何高效處理染料廢水，已成為全世界關(guān)注的主要問題之一[2]。目前處理染料廢水的方法主要分為物理法、化學法和生物法3類[3]。其中生物法運行成本低，綠色環(huán)保，具有較大的研究價值。現(xiàn)有研究顯示，具有脫色染料功能的生物有細菌、真菌和藻類等[4]。楊春霖研究發(fā)現(xiàn)黃絲衣霉菌（Byssochlamys Fulva）對亞甲基藍染料廢水具有良好的脫色效果[5]；張桐等人研究的一栓孔菌ZT-197（Trametes versicolor）對亞甲基藍染液的脫色率高達98%[6]。

木質(zhì)素降解酶作用是生物脫色的主要機制，木質(zhì)素降解酶包括：漆酶（laccase，Lac）、木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）和錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）[7]。漆酶具有較強的氧化還原能力，可對多種染料進行脫色[8]，木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶是兩種常見的過氧化物酶，能夠有效分解木質(zhì)素和多種有機物[9]。木霉菌是目前產(chǎn)纖維素酶量最高的菌株，能夠有效降解纖維素[10-11]。有效利用纖維素酶，將纖維素轉(zhuǎn)化成人類可利用的能源十分重要[12]。

本試驗從女貞樹樹干上分離得到菌株B7，從楊樹樹干上分離得到菌株N38，并對其進行固體脫色篩選。菌株B7、N38 對孔雀石綠、亞甲基藍的脫色效果均為明顯。在進行固體培養(yǎng)基脫色篩選時，兩株菌株在添加孔雀石綠染料的培養(yǎng)基里生長速度明顯慢于其他染料培養(yǎng)基，因此選擇對亞甲基藍進行脫色優(yōu)化試驗。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

N38、B7菌株均來源于貴州大學校園內(nèi)楊樹、女貞樹枝干，通過真菌分離法獲得，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

PD 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL；PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、一次蒸餾水1 000 mL；PDB 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL；碳源篩選培養(yǎng)基：添加可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖作為碳源，分別添加20 g·L-1至PD 培養(yǎng)基中，pH 未調(diào)節(jié)；氮源篩選培養(yǎng)基：添加硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、蛋白胨、尿素作為氮源，分別添加1.0 g·L-1至PDB 培養(yǎng)基中，pH 未調(diào)節(jié)；金屬源篩選培養(yǎng)基：添加硫酸鋅、硫酸鉀、硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸錳作為金屬源，分別添加1.0 g·L-1至PDB培養(yǎng)基中，pH未調(diào)節(jié)。

1.1.3 染料與試劑

活性染料：活性黑、活性紅；堿性染料：孔雀石綠、亞甲基藍、剛果紅、結(jié)晶紫；酸性染料：鉻黑T。次氯酸鈉溶液、無水乙醇、75%酒精、蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 菌株形態(tài)學鑒定

在超凈工作臺中，用9 mm 的無菌打孔器截取已活化的菌株B7、N38 的菌柄至新的PDA 固體培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫箱中避光培養(yǎng)，記錄菌落的生長情況（形態(tài)、直徑）[13]。培養(yǎng)6 d 后，用光學顯微鏡進行形態(tài)學觀察、鑒定，參照《真菌鑒定手冊》[14]。

1.2.2 菌株分子生物學鑒定

提取菌株的DNA 時使用Plant Direct PCR Kit(Finnzymes，F(xiàn)inland)真菌DNA 提取試劑盒，通過PCR擴增得到引物ITS1 和ITS4[15]。并送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序。同時從NCBI 獲得相關(guān)可靠的結(jié)果進行比對，利用MEGA7.0對上述分子序列進行多序列比對，采用MEGA7.0 中鄰接法（Neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并結(jié)合菌株的形態(tài)特征證實該菌株的物種種類[16]。

1.2.3 菌株B7、N38 漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶活性測定

將70 mL PDB 分別裝入250 mL 的三角瓶中，高溫下用低壓的熱蒸汽在每個滅菌鍋121 ℃下，滅菌30 min 后在每個新的三角瓶內(nèi)分別重新接入4 片菌柄(d=9 mm)后并置于每一個新的三角瓶中，置于28 ℃下的恒溫中心后進行一次避光滅菌培養(yǎng)，將第2 d、4 d、6 d、8 d 和10 d 的發(fā)酵液吸取1.0 mL，再將其進行5 min 轉(zhuǎn)速為7 000 r·min-1的離心，然后用紫外分光光度計測定其酶活性。

Lac 活性測定[17-18]：將PH 值為5 的1.95 mL 羥基檸檬酸-羥基磷酸氫二鈉緩沖液、1.0 mmol·L-12,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]和0.05 mL 的上清發(fā)酵液置于30℃的電熱水浴中3 min 后，測定它在3 min 內(nèi)420 nm 處的強度吸光劑在照射下的強度及其值的變化改變，每個測定過程及其中的吸光處理均需要重復3 次。一個氧化酶的生物活力學計量單位(U)被定義為每分鐘可以通過酶催化底物氧化1.0 μmol ABTS 底物時所需酶的總數(shù)量（ABTS：ε420=3.6×104L·mol-1·cm-1）。

MnP 活性測定光劑[18-19]：0.84 mL 上清濃度為0.05 mol·L-1的羥基丙二酸鈉鹽水溶液、0.05 mL 上清濃度為0.01 mol·L-1的硫酸錳溶液、0.05 mL 上清濃度為0.01 mol·L-1的2,6-二甲氧基乙酰苯酚(2,6-dimethoxyphenol，2,6-dmp)、0.05 mL 上清濃度發(fā)酵液和0.01 mL 上清濃度按照比例測量為0.01 mol·L-1的雙氧水裝入一個吸光比色皿中，測定1 min 內(nèi)468 nm內(nèi)皿處的各種吸光劑在照射下的強度和數(shù)值的活性變化，每個比色皿中的強度處理均勻后可以同時重復3 次。一個氧化酶的整體活力學計量單位(U)被定義為每分鐘可以通過催化底物氧化1.0 μmol 2,6-dmp底物的整體所需氧化酶量（2,6-DMP：ε468=4.68×104L·mol-1·cm-1）。

LiP 活性測定[6,18]：將混合后的溶液1.7 mL 濃度相差為0.25mol·L-1的四水合酒石酸鉀鈉溶液和0.05 mL濃度相差為0.1 mol·L-1的藜蘆醇(veratryl alcohol，VA溶液置于30 ℃的水浴中進行預(yù)熱后，依次在鍋中加入0.05 mL 上清發(fā)酵液和濃度為0.1mol·L-1的0.05 mL 雙氧水，測定其在3 min內(nèi)310 nm 處吸光光度值的變化，每個處理均重復3 次。一個酶的活力學單位(U)被定義為每分鐘可以通過催化氧化1.0 μmol VA 物所需酶量（VA：ε310=9.3×103L·mol-1·cm-1）。

1.2.4 固體培養(yǎng)基脫色篩選

添加50.0 mg·L-1活性紅、活性黑、孔雀石綠、剛果紅、亞甲基藍、鉻黑T、結(jié)晶紫至PDA 培養(yǎng)基中，121 ℃下高溫高壓蒸汽滅菌30 min。在超凈工作臺中將加入不同染料的PDA（20 mL）倒入直徑90 mm 的培養(yǎng)皿中，用9 mm 的無菌打孔器截取已活化菌株B7、N38 的菌柄至不同染料的PDA 固體培養(yǎng)基上，上述操作重復3 次。再做一組不接菌的空白對照，每個染料作一組空白對照（7組）。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)10 d，根據(jù)接菌組的脫色圈大小及顏色變化與對照組相比較，計算菌株B7、N38 對不同染料的脫色率，RD為染料脫色率，A1為脫色圈直徑，A0為對照組染料區(qū)域直徑，計算公式為：RD（%）=A1/A0×100[20]。

1.2.5 碳源種類對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

添加麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖作為碳源，分別添加20 g·L-1的碳源至染料終質(zhì)量濃度50.0 mg·L-1的PD 培養(yǎng)基作為碳源篩選培養(yǎng)基，在100 mL 三角瓶中裝入50 mL 碳源篩選培養(yǎng)基。以同樣濃度的PD染料培養(yǎng)基作為對照組。

1.2.6 氮源種類對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

添加硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、蛋白胨、尿素作為氮源，分別添加1.0 g·L-1的氮源至染料終質(zhì)量濃度50.0 mg·L-1的PDB 培養(yǎng)基作為氮源篩選培養(yǎng)基，將50 mL 氮源篩選培養(yǎng)基裝入100 mL 三角瓶中。以同樣濃度的PDB染料培養(yǎng)基作為對照組。

1.2.7 金屬源種類對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

添加硫酸鋅、硫酸鉀、硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸錳作為金屬源，分別添加1.0 g·L-1的金屬源至染料終質(zhì)量濃度50.0 mg·L-1的PDB 培養(yǎng)基作為金屬源篩選培養(yǎng)基，將50 mL 金屬源篩選培養(yǎng)基裝入100 mL 三角瓶中。將同樣濃度的PDB染料培養(yǎng)基作為對照組。

1.2.8 裝液量對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

將濃度為50.0 mg·L-1PDB 染料培養(yǎng)基分裝90.0 mL、70 mL、50 mL、30 mL、10 mL 于100 mL 三角瓶瓶中。

1.2.9 pH值對菌株B7、N38脫色亞甲基藍的影響

將PDB培養(yǎng)基染料濃度調(diào)至50.0 mg·L-1，分別倒入100 mL三角瓶中，高溫高壓蒸汽滅菌30 min。在超凈工作臺中用已滅菌的過濾器過濾NaOH、HCL，用NaOH、HCL將培養(yǎng)基調(diào)整為pH3、pH5、pH7、pH9、pH11。

1.2.10 染料吸光值的測定、脫色率的計算及數(shù)據(jù)分析

分別取4 片菌柄（d=6 mm）于上述三角瓶中，重復3次。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)10 d，每2 d在超凈工作臺中取1.8 mL 染料發(fā)酵液，經(jīng)1 2000 r·min-1離心2 min，取1.0 mL 上清液于紫外分光光度計波長為662 nm 測量其OD 值。液體染料脫色公式為RD=（C0-C1）/C0×100%[17]。C0為未接菌PDB 染料培養(yǎng)基的光度值，C1為已接菌的染料發(fā)酵液，RD為液體染料脫色率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株N38和B7形態(tài)學觀察、DNA的提取及ITS系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株N38 和B7 于恒溫培養(yǎng)箱中，4 d 即可長滿培養(yǎng)皿（見圖1）。提取菌株B7、N38 的DNA 后，進行引物擴增得到PCR 產(chǎn)物送其測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。獲得測序結(jié)果后登錄網(wǎng)站GenBank，得到菌株N38 的登錄號MZ461912.1，菌株B7 的登錄號OK021633.1。

圖1 菌株N38、B7的菌落形態(tài)學觀察

圖2 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的活性變化

培養(yǎng)第2 d 開始監(jiān)測菌株N38 產(chǎn)酶活性，其酶活性隨時間的增長呈現(xiàn)先增長再降低的趨勢。Lac 活性在第8 d 時達到峰值，其酶活力為9.27 U·L-1；MnP 活性也在第8 d 達到最大值，為16.53U·L-1；而LiP 活性在第6 d達到最大值，為7.66U·L-1（見圖3a）。

培養(yǎng)第2 d 開始監(jiān)測菌株B7 產(chǎn)酶活性，其酶活性隨時間的增長呈現(xiàn)先增長再降低的趨勢。Lac 活性與MnP 活性均在第6 d 達到峰值，其酶活力分別為13.31 U·L-1、11.29 U·L-1；LiP 活性在第8 d達到峰值，為5.24 U·L-1（見圖3b）。

圖3 漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活性變化

2.3 菌株B7、N38對7種分屬不同類別染料脫色篩選

將菌株接種在添加孔雀石綠、剛果紅、鉻黑T、活性黑、活性紅、結(jié)晶紫、亞甲基藍的固體染料培養(yǎng)基上。觀察后發(fā)現(xiàn)，菌株B7對孔雀石綠和亞甲基藍脫色都很明顯，脫色率分別為92.78%、92.22%，對剩余染料的脫色率由高到低依次為：結(jié)晶紫（79.22%）、鉻 黑T （64.44%）、活 性 紅（50.00%）、剛 果 紅（44.44%）、活性黑（41.11%）（見圖4a）；菌株N38 對亞甲基藍的脫色效果最佳，脫色率為92.78%，對活性紅、結(jié)晶紫、剛果紅三種染料脫色率相同，均為88.89%，對剩余染料的脫色率由高到低依次為：孔雀石綠（82.22%）、活性黑（5.00%）、鉻黑T（3.33%）（見圖4b）。

圖4 菌株對7種染料的脫色率

2.4 菌株N38、B7脫色亞甲基藍受碳源種類的影響

脫色第10 d，添加葡萄糖作為碳源時的脫色效果最好，脫色率達84.92%；其次果糖與麥芽糖效果較為接近，脫色率分別為73.38%、70.43%；蔗糖和淀粉脫色率略低，依次是68.64%、48.13%。依結(jié)果可見淀粉作為碳源對N38 脫色效果并不佳，與其他碳源差距明顯（見圖5a）。

脫色第10 d，添加葡萄糖作為碳源時的脫色效果最好，脫色率達83.01%；果糖、蔗糖與淀粉效果較為接近，脫色率分別為77.99%、70.74%、69.57%；麥芽糖脫色率最低，僅54.66%。結(jié)果顯示麥芽糖作為碳源對N38 脫色效果不佳，與其他碳源差距明顯（見圖5b）。

圖5 碳源對菌株脫色亞甲基藍的影響

2.5 菌株N38、B7脫色亞甲基藍受氮源種類的影響

五種氮源中，以氯化銨為氮源的脫色效果最佳，脫色率為93.21%；添加蛋白胨與尿素脫色效果次之，脫色率依次為74.28%、76.12%；添加硫酸銨的脫色率為65.09%；而硝酸鈉添加后脫色效果最差，脫色率為54.34%。綜上所述，添加氯化銨作為氮源對菌株N38脫色亞甲基藍效果明顯（見圖6a）。

五種氮源中，以硝酸鈉為氮源的脫色效果明顯，脫色率為80.31%；添加蛋白胨，脫色效果次之，脫色率為75.44%；添加尿素、氯化銨和硫酸銨的脫色效果明顯降低，脫色率依次為：27.17%、25.38%、15.29%。綜上所述，添加硝酸鈉作為氮源對菌株B7脫色亞甲基藍效果明顯（見圖6b）。

圖6 氮源對菌株脫色亞甲基藍的影響

2.6 菌株N38、B7脫色亞甲基藍受金屬離子種類的影響

鎂離子的添加對菌株N38脫色亞甲基藍效果最佳，脫色率為88.80%；其余四種金屬離子脫色效果都較為接近，添加鋅離子、鐵離子、錳離子、鉀離子為金屬源對菌株N38 脫色亞甲基藍效果十分接近，脫色率分別為78.47%、76.60%、76.21%、71.42%（見圖7a）。

鋅離子的添加對菌株B7脫色亞甲基藍效果最佳，脫色率為91.18%；鉀離子、鎂離子脫色效果都較為接近，其脫色率依次是：85.73%、82.78%；添加錳、鐵離子作為金屬源的脫色率較低，依次為69.93%、59.62%（見圖7b）。

圖7 金屬離子對菌株脫色亞甲基藍的影響

2.7 菌株N38、B7脫色亞甲基藍受裝液量的影響

裝液量為30 mL 時，脫色效果最佳，脫色率為99.11%；裝液量為10 mL 時脫色效果也同樣很好，脫色率為95.75%；其余3 種裝液量脫色效果隨著裝液量增加，脫色率下降，裝液量為50 mL、70 mL、90 mL時，脫色率依次為85.01%、65.41%、50.56%。當裝液量達到90 mL 時脫色率明顯低于其余4 種裝液量（見圖8a）。

裝液量為10 mL 時，脫色效果最佳，脫色率為90.56%；裝液量為30 mL 時脫色效果略低于10 mL 時，脫色率為86.86%；隨著裝液量增加脫色率不斷下降，裝液量為50 mL、70 mL 和90 mL 時，脫色率依次為68.59%、67.07%、31.95%。當裝液量達到90 mL 時，脫色率明顯低于其余4種裝液量（見圖8b）。

圖8 裝液量對菌株N38脫色亞甲基藍的影響

2.8 菌株N38、B7脫色亞甲基藍受pH值的影響

培養(yǎng)基pH 值不同，菌株的脫色能力也差異顯著。當pH 值由3.0 增加至5.0 時，脫色效果明顯增加，脫色率由15.88%增加為73.05%；當pH 值為7 時脫色效果最佳，脫色率為77.99%；隨著pH 值繼續(xù)增大時，脫色率下降趨勢明顯，pH 值為9 時脫色率為14.19%；pH 值為11 時脫色率為10.22%。綜上所述，菌株N38在極酸極堿的條件下脫色能力差（見圖9a）。

受pH 值的影響，菌株的脫色能力也差異顯著。當pH 值為3.0 時，脫色效果最佳，脫色率為97.30%；而pH 值為5 時脫色率為73.99%；當pH 值為7 時脫色率也，脫色率為93.93%；但隨著pH 值繼續(xù)增大時，脫色率下降趨勢明顯，pH 值為9 時脫色率為13.54%；pH 值為11 時脫色率為13.03%。綜上所述，菌株N38在極堿的條件下脫色能力差，培養(yǎng)基pH 值位于3 時，菌株B7脫色亞甲基藍能力最強（見圖9b）。

圖9 pH值對菌株脫色亞甲基藍的影響

3 討論

本試驗從貴州大學校園內(nèi)的女貞樹枝干上分離、純化得到菌株B7，從楊樹樹干上分離、純化得到菌株N38。根據(jù)菌株的形態(tài)學特征、ITS序列相似性比對以及進化樹分析，鑒定B7 為哈茨木霉菌Trichoderma harzianum；N38 為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。哈茨木霉為半知菌亞門絲孢綱叢梗孢目科木霉屬，廣泛分布于森林生態(tài)系統(tǒng)中，其適應(yīng)性極強，對多種病原真菌和細菌都有拮抗作用[21]，是一類重要的生防真菌，廣泛存在于空氣、土壤以及植物體表面等生境中，具有強適應(yīng)力、存在范圍廣和廣譜、高效等優(yōu)點[22]。葡萄座腔菌是一種重要的植物內(nèi)生菌[23]。通過木質(zhì)素過氧化物酶的測定，可知兩菌株具有一定的脫色能力。B7、N38 的漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的酶活峰值出現(xiàn)在6～8 d，與喬喬研究的木質(zhì)素過氧化物酶的酶活峰值為第6～8 d 結(jié)果相同[24]。為了研究兩菌株在不同條件下對亞甲基藍脫色能力，本試驗測定了不同碳源、氮源、金屬離子、pH值和裝液量條件下對菌株脫色亞甲基藍的影響。結(jié)果顯示添加葡萄糖作為碳源，菌株N38、B7 脫色亞甲基藍效果最佳，推測菌株N38、B7 在添加葡萄糖時，可促進其對亞甲基藍脫色。徐紅云在一色齒毛菌的脫色試驗中，添加葡萄糖作碳源的脫色效果也最佳[25]；添加氯化銨作為氮源，菌株N38脫色效果最佳。菌株B7在添加硝酸鈉作為氮源時，脫色效果最佳。而一色齒毛菌脫色剛果紅時，添加硝酸銨作氮源效果最佳[26]，考慮是菌株不同，對氮源的需求也不同；添加硫酸鎂作為金屬源，菌株N38脫色亞甲基藍效果最佳。菌株B7在加入鋅離子作為金屬源時，脫色率高達91.18%。由此可見，金屬離子是微生物生長中不可或缺的一部分，少量的金屬離子可以促進菌株的生長[27]；培養(yǎng)基pH值為7 時，菌株N38 脫色亞甲基藍效果最佳。菌株B7在pH 值為5的條件下，脫色效果明顯。與周菲結(jié)論相對應(yīng)，其研究的哈茨木霉脫色活性艷藍KN-R 的最適培養(yǎng)條件為pH 值為5.5[28]，推測pH 值為5 左右時，最適合哈茨木霉生長；當裝液量為10 mL 時，菌株N38、B7脫色亞甲基藍脫色率均達到90%以上。隨著裝液量的升高，脫色率逐漸降低，印證了姚英等的結(jié)論：當裝液量為10 mL 時，脫色效果最佳，但是在染液量超過菌株自身承載范圍時，脫色效果大大降低[26]。推測菌株對染料脫色有一定的能力范圍，因此當接菌量一定時，裝液量越少脫色效果越明顯。葡萄座腔菌在脫色優(yōu)化方面暫無報道，在生態(tài)發(fā)展的時代，微生物降解染料廢液備受關(guān)注。綜合本研究結(jié)果，菌株N38、B7可脫色染料亞甲基藍，這對染料廢水的治理具有一定借鑒和指導價值。