實時熒光定量PCR技術在本科實驗教學中的應用探討

張賀翠，馮 萍，李幫秀，薛雨飛，楊 昆，朱利泉

（西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715）

分子生物學是生物學的前沿與生長點，是指從分子水平研究生物大分子的結構與功能從而闡明生命現象本質的科學，它同時是一門理論與實踐相結合的綜合性的新興學科[1]。分子生物學主要的研究領域是蛋白質體系、蛋白質-核酸體系（中心是分子遺傳學)和蛋白質-脂質體系（即生物膜），它目前是農林院校生物專業和涉農專業的重要課程，分子生物學實驗技術已成為生命科學領域普遍運用的方法和手段，實驗課是一門讓學生理解、掌握分子生物學技術的課程[2]。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種根據生物體內DNA 半保留式復制的特點而設計的在體外對特定的DNA 序列放大擴增的新技術。PCR 反應最大的特點是將微量的DNA 進行快速大幅度的擴增，例如化石中的古生物，或者脫落許久的毛發甚至皮膚中只要有一點點DNA都可以通過PCR技術加以擴增和放大，因此目前在分子生物學及其相關學科中得到廣泛的應用[3]。

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技術是在普通的聚合酶鏈式反應基礎上發展起來的一種高度靈敏的核算檢測技術[4]。qRT-PCR的基本原理是在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[5]。由于qRT-PCR技術較常規PCR 技術相比，具有污染少、定量準確、實時監測、自動化程度高等優點，qRT-PCR 技術在目前的科學研究中大量使用，經常在轉基因檢測、作物育種、環境科學及醫學等領域中使用[6]。例如新冠肺炎病毒的核酸檢測，通過qRT-PCR技術檢測熒光信號累積確定是否有新型冠狀病毒，如果是帶有病毒的患者會檢測出熒光信號增強，這樣就可以顯示陽性的結果。如果是核酸檢測沒有病毒的患者樣本，因為沒有靶基因的擴增，就檢測不到熒光信號增強，這樣的結果就屬于新冠肺炎核酸檢測陰性[7]。NCBI 中可以搜索到的使用qRT-PCR 做基因表達分析的文章至少20 萬篇，中國知網上收集的基因表達的文章至少2 萬篇。例如西南大學農學與生物科技學院年均發表80 余篇與此相關的文章，其中水稻、油菜等科研團隊在應用實時熒光定量PCR 技術方面取得了一系列重大成果，其相關研究成果在Plant Cell、PNAS、Nucleic Acids Research等國際學術刊物發表。

但是由于購買熒光定量PCR 儀成本高，維護費用高，每個學生的使用成本在30元左右，限制了其在本科生教學中的使用，但是近年來，如何在本科生的實驗教學中讓學生掌握以后的科研工作中常用的基本實驗技術，培養本科生的綜合能力和科研素養，促進教學與科研的相互融合已經成為實驗教學改革的重要方向[8]。因此，我們在本科生的教學工作中初步進行了不同氮肥施用量下團棵期煙葉葉片中NtCIPK8的定量表達，并取得了較好的數據，讓本科生了解到環境因素也會影響基因的表達，由于進行的qRT-PCR 實驗涉及到引物的設計、內參基因的選擇、RNA 樣本制備及純化、反轉錄cDNA、相對定量法中內參基因的校準和樣品基因的定量檢測，掌握到這些基本的實驗技術。

1 材料與方法

1.1 教學安排

1）實時熒光定量PCR 實驗操作及結果分析共計6個學時；2）實驗分組：每2個學生一組；3）學生提前預習熒光定量PCR 的原理、實驗方法、操作步驟及注意事項；4）實驗結束后，課堂上進行實驗結果的分析和討論，學生提交實驗報告。

1.2 實驗材料

材料：培養箱培養煙草植株到五葉一心期進行移栽，設置純氮使用量75.0 kg·hm-2（T1）、90.0 kg·hm-2（T2）、105.0 kg·hm-2（CK） 112.5 kg·hm-2（T3）、120.0 kg·hm-2（T4）、135.0 kg·hm-2（T5）、150.0 kg·hm-2（T6）、165.0 kg·hm-2的8 個處理，其他施肥參照常規施肥方案進行施肥，移栽后植株長到團棵期取葉片，液氮中凍存后放到-80 ℃冰箱保存。

1.3 實驗儀器

熒光定量PCR 儀定為BIO-Rad CFX Connect Real-Time PCR System，凝膠電泳裝置，微量核酸測定儀。

1.4 實驗方法

使用RNA 植物提取試劑盒（天根）從8 個處理的葉片中提取RNA，并純化，利用高質量的反轉錄試劑盒將純化后的RNA 進行反轉錄，以β-Actin 為內參基因擴增NtCIPK8基因的表達量（見表1）。樣本每個處理重復3 次，反應體系為20 μL：2 μL cDNA，上、下游引物各0.6 μL，SYBR10.4 μL，ddH2O 補齊20 μL，反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，57 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40 個循環，重復3 次。反應結束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線。基因的相對表達量采用2-ΔΔCT計算[9]。

表1 NtCIPK8和β-Actin的引物序列

2 結果與分析

2.1 不同氮肥施用量的煙葉團棵期葉片總RNA的提取

以8 個處理的煙葉葉片為材料，參照植物總RNA提取試劑盒說明書提取煙葉葉片重的總RNA，通過超微量分光光度計檢測其OD 值和濃度，發現本實驗中所提取的葉片中RNA 純度（OD260/280）值均在1.8～2.1，表明RNA 純度較高，可以用于后續的反轉錄和擴增實驗。

將提取的RNA 經1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳分離，如圖1 所示，各RNA 條帶明亮而沒有降解，28S 和18S 條帶在亮度上接近2∶1，5S 條帶較暗，表明RNA 的純度和完整性較好，能夠用于后續實驗分析。

圖1 不同氮肥施用量的煙葉團棵期葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 PCR產物的溶解曲線

從圖2、圖3 可知，內參基因β-Actin 和8 個處理的煙葉葉片的NtCIPK8基因的溶解曲線均為單一峰，沒有其他峰的出現，同時圖3中的峰的形狀比較銳利，表明NtCIPK8基因在不同處理下的溶解溫度均一性比較好，同時表明PCR 擴增產物的特異性好，沒有出現非特異性擴增。

圖2 溶解曲線1

圖3 溶解曲線2

2.3 NtCIPK8基因擴增曲線

圖4 的擴增曲線分成了3 個階段，分別是熒光背景階段、熒光信號指數擴增階段及熒光信號擴增平穩期。基因擴增曲線整體光滑且平穩性較好，形狀“S”完整性好，符合熒光定量檢測的要求。

圖4 基因擴增曲線

2.4 不同處理下煙葉團棵期葉片中NtCIPK8表達量

圖5 結果表明：通過熒光定量PCR 數據發現在不同處理下團棵期的葉片中NtCIPK8均有表達，呈現了先上升后下降的趨勢，不同處理后煙葉葉片團棵期NtCIPK8的表達存在差異。其中在處理T3（純氮7.5 kg/667 m2）的葉片中NtCIPK8的表達量最高，處理T1（純氮5.0 kg/667 m2） 的葉片中NtCIPK8的表達量最低。

圖5 不同處理下團棵期的葉片中NtCIPK8表達量

3 結論與討論

學生們通過獨自提取RNA 并純化、反轉錄、使用熒光PCR 儀擴增了8 個處理下煙葉中NtCIPK8的表達量，CIPKs 一類蛋白激酶家族，它是Ca2+感受器CBLs（Calcineurin B-like proteins，CBLs）的靶蛋白，CIPK與CBL 形成復合體[10]；Ca2+與CBL 結合后，CBLs 的構型發生變化，它的疏水性結合位點暴露到外面，疏水性結合位點與CIPKs 的NAF 結構域結合，促使CIPKs釋放自抑制區，CBL/CIPK復合體被激活，從而調控細胞的代謝[11]。CIPK8 是CIPKs 的家族成員，它可能參與了植物的脅迫信號途徑[12]，同學們通過獨自提取RNA 并純化、反轉錄、使用熒光PCR 儀擴增了8 個處理下煙葉中NtCIPK8的表達量，通過熒光定量PCR 擴增了8 個處理下煙葉中NtCIPK8的表達量不僅使學生們掌握了實驗技術，還了解了不同施氮量下相同組織中同一個基因的表達量也會不同，將基因表達的特點從一個抽象的概念轉化為了具體的數字圖形。

由于涉及到引物的設計、內參基因的選擇、RNA 樣本制備及純化、反轉錄cDNA、相對定量法中內參基因的校準和樣品基因的定量檢測，實驗步驟繁瑣，容易由于所使用的試劑及操作者的技術造成實驗結果誤差較大，甚至會出現失敗的現象[13]。其中qRT-PCR 的引物設計和內參基因的選擇至關重要，引物設計過程中設計到引物二聚體、發夾結構、非特異性擴增、退火溫度的選擇等，均會影響實驗的結果[5]；篩選到合適的內參基因進行校正和標準化，可以給靶基因提供參考數據，同時可以消除因模板濃度不同帶來的實驗誤差。提取樣品RNA 的時候要特別注意RNA 的降解和污染，要使用無RNA 酶的器皿等。

本次實驗是一次探索性的教學實驗，由本科生為主體，老師作指導，綜合一系列實驗而最終獲得結果，所得實驗結果與研究生做的實驗數據相一致，表明本科生通過提前預習、課堂講解、實際操作是可以達到較高的水平的，這里也顯示出實驗整體設計的重要性，整個研究項目進行合理的規劃設計就可以使得學生們容易操作，實驗誤差減少。

該實驗項目具有較強的連貫性和綜合性，雖然實驗成本較高，對學生的理論知識和操作技能也都有較為嚴格的要求，但是我們應該以“雙一流”學科建設和“新農科”人才培養為契機，以教育部《實驗教學示范中心建設標準》《專業實驗室評估標準》為標準，秉承傳授知識、培養能力、提高素質的指導思想，緊緊圍繞提高本科教學質量，建設高水平的農學類、生物類實驗教學共享平臺；深化實驗教學改革和管理體制改革，構建與專業人才培養目標相適應的實驗教學體系，建立功能完善、結構合理、管理高效的實驗室運行機制和管理體系；優化實驗隊伍結構，提高實驗教師專業技術水平，建立專兼職有機結合的高素質實驗教學隊伍；遵循“高起點、新思路、有特色、重效用”的原則，突出重點、分期建設，加強中心信息化、設備更新、創新實驗室和實習基地等建設，夯實實驗教學在創新人才培養等方面的重要作用。

4 結語

利用實時熒光定量PCR 技術檢測基因表達量可以讓學生快速地掌握基因表達檢測技術，數字、柱形圖等可以讓學生直觀地了解基因在器官和組織的表達狀況。提高本科生培養質量，充分發揮實驗室在實踐和創新能力培養中的特殊作用，凸顯本科教育的特色，提高學生的綜合實驗技能，以實驗教學來進一步促進理論教學，同時能提高各專業學生解決具體問題的能力，為培養本科生創新意識和開展更深層次的研究工作打下良好的基礎。