檢測環境水體中銀離子含量的新型碳基光學傳感器

胡 云， 陳中庸， 周芯吉， 劉美紅， 周 希,*

(1.中國林業科學研究院 林產化學工業研究所；生物質化學利用國家工程實驗室；國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室；江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042； 2.南通大學 化學化工學院，江蘇 南通 226019)

金屬銀作為工業社會的重要原料，被普遍用于制藥、電氣和航空航天等領域[1]。銀離子較易被生物體吸收，經過食物鏈富集會對人體的免疫系統、消化和神經系統造成損害，是最具毒性的貴金屬離子之一[2]。根據我國新版生活飲用水衛生標準，飲用水中Ag+含量不得高于0.05 mg/L，因此，對水體環境中Ag+檢測一直是熱點研究問題[3]。目前常規的Ag+檢測方法有原子吸收光譜測定法、電感耦合等離子體發射光譜法、電化學法等[4]。然而，這些方法涉及的儀器設備昂貴且樣品前處理過程繁瑣，限制了它們在銀離子快速檢測領域的應用。因此，亟需開發一種簡單高效且靈敏度高的銀離子檢測技術。近年來，碳量子點(別名碳納米點，CQDs)作為尺寸在10 nm以下具有光學性質的新型碳基材料，可作為光學傳感器廣泛應用于環境檢測、化學與生物傳感、食品分析等領域[5]。目前制備碳量子點的方法有電化學氧化法、微波輻照法、電弧放電法、水熱炭化法等[6]。碳量子點在制備過程中通常是由微波輻照、酸處理、電化學或加熱技術引發，從而形成共軛碳芯[7]。因此，發展低成本、簡單易行且可大規模生產的制備技術成為碳量子點目前研究的難點與熱點。池毓務團隊[8]于2012年首次通過熱解檸檬酸合成了碳基熒光材料，得到具有顯著熒光效應的碳量子點。Liu等[9]通過將秸稈粉碎處理后，在250 ℃條件下水熱反應10 h，制得碳點并成功應用于銅離子光學探針檢測。

木質素是一種芳香族天然聚合物，在自然界中來源廣泛、儲量巨大且無毒[10-12]。木質素結構中豐富的芳香基團和較高的含碳量，被認為是制備CQDs優良的前驅體。本研究將木質素磺酸鈣作為制備CQDs的主要原料，通過超聲波輔助處理及大分子自組裝得到具有光學性能的CQDs，探究木質素及還原劑NaBH4濃度對CQDs熒光性能的影響，考察CQDs對Ag+的響應識別性能及其細胞毒性，以期為將CQDs應用于環境水體中Ag+濃度檢測及食品醫藥分析提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

木質素磺酸鈣，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；pH值7.0磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L，PBS)、NaBH4、硫酸喹啉、AgNO3、無水乙醇，二甲亞砜，均為市售分析純。超純水、Hela細胞，南京凱基生物科技發展有限公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)，西亞化學科技(山東)有限公司。胎牛血清(FBS)和DMEM達爾伯克細胞培養基(DMEM)，美國Sigma-Aldrich公司。

Nicolet IS50型傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；JEM-2100 PLUS透射電子顯微鏡(TEM)，日本電子株式會社；Nano ZS ZEW 3600激光粒度測試儀，英國馬爾文公司；RS-5301熒光光譜儀和UV-2600i紫外可見分光光度計，日本島津公司；UPHI 5700 Versa ProbeX射線光電子能譜(XPS)儀，日本UIVAC-PHI公司。

1.2 木質素基碳量子點(CQDs)的制備

取20 mL無水乙醇，分別按質量濃度10～100 g/L稱取木質素磺酸鈣，加入并攪拌至完全溶解。隨后超聲波處理1 h，移入50 mL反應釜中，在150 ℃溫度下反應12 h，冷卻至室溫后，離心分離去除不溶物得到上清液。

在上述上清液中加入還原劑NaBH4(50 g/L)，室溫反應2 h。反應結束后，利用截留分子質量1 000 u透析袋將所得反應液透析48 h除去鈣離子，最后冷凍干燥得到CQDs粉末。

按上述操作實驗還考察了木質素磺酸鈣質量濃度60 g/L時，不同質量濃度(10～100 g/L)還原劑NaBH4對CQDs的熒光強度的影響。

1.3 分析與表征

1.3.1激光粒度及TEM分析 先使用去離子水配制10 g/L CQDs溶液置于U型樣品池中，采用激光粒度測試儀對樣品粒徑進行分析。將CQDs溶液滴于超薄碳膜表面，待自然風干后采用透射電子顯微鏡觀察其形貌與尺寸，測試加速電壓200 kV。

1.3.2FT-IR分析 通過KBr壓片制得測試樣品，采用紅外光譜儀掃描樣品，波長范圍500～4000 cm-1。

1.3.3XPS分析 通過光電子能譜儀考察CQDs表面化學組成與化學態，采用Al Kα射線(hv=1 340 eV)為X射線源，污染碳C1α(Ea=230 eV)為能量校正。

1.3.4紫外光譜分析 采用紫外可見分光光度計對CQDs溶液進行掃描，波長范圍200～800 nm，掃描間隔為0.5 nm。

1.3.5熒光光譜分析 采用熒光光譜儀對CQDs溶液進行掃描，掃描范圍200～600 nm，發射和激發光譜波長分別為340～600 nm和200～425 nm，激發和發射狹縫均為5 nm。

1.3.6熒光量子產率的測定 采用參比法測定熒光量子產率。分別測定參比標準物硫酸喹啉(YQ為55%)和CQDs溶液在相同激發波長下的熒光積分面積(I)和吸光度值(A)，再根據式(1)計算熒光量子產率(YCQDs)：

(1)

式中：YQ—硫酸喹啉熒光量子產率,55%；ACQDs、AR—CQDs和硫酸喹啉吸光度；ICQDs、IR—CQDs和硫酸喹啉熒光積分面積；nCQDs、nR—CQDs和硫酸喹啉溶劑折光率。

1.4 CQDs的應用

1.4.1熒光光譜法測定Ag+采用PBS溶液配制0.05 g/L的CQDs溶液。取300 μL混合CQDs溶液、 1 200 μL AgNO3溶液(0～500 μmol/L)和1 500 μL超純水置于比色皿中混合，搖勻后在室溫下靜置5 min，隨后測定在340 nm激發波長下的熒光發射光譜，平行測定3次。按相同操作測定其他不同金屬離子(400 μmol/L)與CQDs混合溶液在340 nm激發波長下的熒光發射光譜。

1.4.2細胞毒性實驗 利用10%的胎牛血清(FBS)的DMEM細胞，將細胞培養基中Hela細胞濃度調整至60 000個/mL，隨后按每孔100 μL(6 000個細胞)轉移至96孔培養板中，在37 ℃、 5% CO2條件下培養24 h。隨后，除去上層清液，將培養液替換成200 μL CQDs溶液(質量濃度分別為0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0 g/L)繼續培養24 h(對照組加入200 μL DMEM培養基)，去除CQDs溶液，并加入20 μL MTT溶液。在37 ℃、 5%CO2條件下連續培養4 h后用150 μL二甲亞砜去除MTT并充分震蕩，然后于490 nm波長處測定實驗組和對照組溶液吸光度。采用相同操作測定未加Hela細胞空白組的吸光度。細胞成活率(η)計算公式見式(2)。

η=(ACQDs-A0)/(Ac-A0)×100%

(2)

式中：ACQDs、A0、Ac—在490 nm處CQDs、空白組和對照組的吸光度。

2 結果與討論

2.1 CQDs制備工藝優化

實驗中考察了還原劑NaBH450 g/L條件下木質素磺酸鈣的質量濃度對CQDs熒光性能的影響，結果如圖1所示。

圖1 木質素磺酸鈣(a)和NaBH4(b)對CQDs熒光強度的影響

由圖可知，在木質素磺酸鈣質量濃度低于60 g/L時，隨著反應過程中木質素磺酸鈣質量濃度增加，所得CQDs濃度增加，其熒光強度逐漸增強。當質量濃度達到60 g/L時，其熒光強度最強。當木質素質量濃度高于60 g/L時，因為內濾效應導致所得CQDs溶液熒光強度減弱。在木質素磺酸鈣為60 g/L條件下，考察NaBH4質量濃度對CQDs熒光性能的影響，結果亦見圖1。由圖可知，當NaBH4質量濃度低于50 g/L時，由于CQDs表面官能團未被充分還原，使得其熒光強度較弱，當NaBH4質量濃度為50 g/L 時其熒光強度最強。繼續提升NaBH4質量濃度，由于CQDs表面含有的羥基、羧基等含氧官能團解離程度發生改變，使得其熒光強度減弱。

2.2 CQDs的結構分析

圖2 木質素磺酸鈣(a)及其碳量子點(b)的紅外譜圖

圖3 木質素基碳量子點的透射電鏡圖Fig.3 The TEM of CQDs

圖4 CQDs的XPS圖(a)及分峰圖(b)

2.3 CQDs的光學性質

圖5 CQDs溶液的紫外吸收(a)與熒光激發(b)、發射(c)光譜圖Fig.5 The spectra of ultraviolet absorption(a), fluorescence excitation(b), and emission(c) of CQDs solution

通過紫外光譜和熒光光譜對CQDs的光學性質進行分析，結果見圖5和圖6。由圖可知，曲線a在300及360 nm處有兩個明顯的紫外吸收峰，前者證實了源自木質素磺酸鈣中多芳基發色團存在，后者歸因于芳香族π結構及含氧官能團[6]。曲線b為發射波長在450 nm處測得的激發光譜(激發波長230～425 nm)，由圖可知最大激發波長為340 nm。曲線c為在340 nm激發光作用下的發射光譜，發現CQDs的最大發射波長在432 nm。同時，通過參比法(以硫酸喹啉為參比物)得到該CQDs的YCQDs為12.4%。當激發波長在310～400 nm之間變化時，對應的CQDs熒光發射強度也隨之變化，表現出明顯的依賴于激發波長變化的特性(圖6(a))。在激發波長340 nm下測定不同pH值(用1 mol/L HCl或NaOH溶液調pH值)的CQDs溶液在432 nm處熒光強度變化情況(圖6(b))顯示：當所得CQDs溶液pH值在1～8之間時，對應熒光強度隨pH值增大而增強。當pH值處于8～10之間時，其熒光發射強度達到最強且較穩定，隨后熒光強度逐漸減弱。這主要是因為在強堿性環境下，生成的羧酸鹽會破壞CQDs表面鈍化層，從而使得熒光強度減弱；當CQDs處于酸性條件下時，CQDs表面的羧基和羥基等含氧官能團易形成氫鍵，誘導CQDs發生聚集并使得熒光猝滅[5]。

圖6 不同激發波長下的CQDs熒光強度(a)及pH值對CQDs熒光強度的影響(b)

2.4 CQDs的應用

圖7 不同濃度Ag+對CQDs熒光強度(a)與熒光猝滅強度比值(b)的變化圖

2.4.2CDQs對細胞的毒性檢測 低生物毒性是納米碳點的優勢之一，同時也是其在細胞內發揮關鍵作用的重要前提[12]。為了驗證所制備CQDs良好的生物相容性和低毒性，通過MTT法檢測其對Hela細胞的生物毒性。實驗結果顯示：隨著CQDs溶液質量濃度(0、 0.01、 0.05、 0.1、 0.5和1.0 g/L)逐漸增加，Hela細胞存活率(分別為99%±2.95%、 94%±2.85%、 93%±2.65%、 92%±2.6%、 95%±2.5% 和90%±2.5%)并未發現有顯著的下降趨勢，甚至當CQDs質量濃度達到1.0 g/L時，并未出現明顯抑制細胞活性的效果。上述實驗結果說明，該CQDs對Hela細胞無明顯生物毒性。

3 結 論

3.1以木質素磺酸鈣為碳源，通過超聲波處理及大分子組裝，設計合成了一種具有熒光特性的水溶性碳量子點(CQDs)，通過FT-IR、XPS和TEM等確證結構。紫外-可見光譜和熒光光譜實驗結果表明：其最大發射波長和最大激發波長分別為432 nm和340 nm，且具有較高的熒光量子產率(12.4%)。

3.2不同質量濃度Ag+溶液對CQDs熒光強度的影響規律：隨著Ag+濃度增加，CQDs熒光逐漸猝滅；在0～250 μmol/L范圍內，Ag+濃度與CQDs熒光猝滅強度比值有良好線性關系(R2=0.998)，檢測限低至525 nmol/L。

3.3離子選擇性試驗和細胞毒性測試表明：其他金屬離子對CQDs熒光猝滅作用較小，CQDs對Ag+熒光選擇性較高且無明顯細胞毒性，有望將其應用于環境水體中Ag+濃度檢測及食品醫藥分析。