基于網絡藥理學探討三棱-莪術藥對治療肝癌的作用機制

華雯 高鴻彬

摘要 目的：采用網絡藥理學方法篩選三棱-莪術藥對治療肝癌的作用靶點以及相關信號通路，明確治療肝癌的作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選出三棱、莪術的有效藥物成分及作用靶點，構建有效成分-靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。從OMIM、DrugBank、TTD數據庫檢索與肝癌相關的疾病靶點，并通過R語言軟件分析獲得三棱-莪術成分與肝癌的交集靶點。應用Cytoscape 3.2.1軟件繪制成分-靶點網絡，并運用DAVID數據庫進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：共篩選出三棱-莪術藥對與肝癌的相對應作用靶點共31個。共涉及與肝癌相關的GO分析125條，主要包括分子功能、生物過程、細胞組分3個方面。KEGG通路82條，主要從一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞對脂多糖的反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控等多處通路治療肝癌。結論：本研究初步驗證了三棱-莪術藥對通過腫瘤壞死因子信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、類固醇激素介導的信號通路等治療肝癌。本研究表明三棱-莪術藥對具有多成分、多靶點的特點，其作用機制多樣，對進一步研究肝癌的治療提供了參考。

關鍵詞 三棱-莪術藥對;肝癌;網絡藥理學;中藥;成分;靶點;通路;作用機制

Discussion on the Mechanism of Action of Rhizoma Sparganii-rhizoma Curcumae Drug Pair on the Treatment of Liver Cancer Based on Network Pharmacology

HUA Wen，GAO Hongbin

（Baoshan Branch of Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200444，China）

Abstract Objective：To screen out the action targets and related signal pathways of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair on the treatment of liver cancer by means of network pharmacology，and to clarify the mechanism of action in the treatment of liver cancer.Methods：The effective ingredients and targets of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair were screened out through the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and the effective ingredient-target Protein-protein Interaction（PPI） network was constructed.We retrieved disease targets related to liver cancer from OMIM，DrugBank，and TTD databases，and used R language software analysis to obtain the intersection target of the Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair component and liver cancer.Cytoscape 3.2. software was used to draw the component-target network，and the DAVID database was used for Gene Ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway analysis.Results：A total of 3 targets of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair turmeric medicine against liver cancer were screened.A total of 125 GO analyses related to liver cancer were involved，including 3 aspects：molecular function，biological process，and cell composition.There were 82 KEGG pathways，mainly from the positive regulation of nitric oxide biosynthesis，the cell′s response to lipopolysaccharide，and the positive regulation of RNA polymerase Ⅱ promoter transcription to treat liver cancer.Conclusion：This study preliminarily verified the treatment of liver cancer by Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair through the tumor necrosis factor signaling pathway，the positive regulation of RNA polymerase Ⅱ promoter transcription，and the steroid hormone-mediated signaling pathway.This study shows that the Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair has the characteristics of multiple components and multiple targets，and its mechanism of action is diverse，which provides a reference for further research on the treatment of liver cancer.

Keywords Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair; Liver cancer; Network pharmacology; Chinese medicinal; Composition; Target; Pathway; Mechanism of action

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.015

目前，原發性肝癌在我國非常常見，近幾年增長趨勢逐漸加快，每年造成30余萬人死亡，成為我國腫瘤致死的第2大“元兇”，對人民的生命和健康安全產生了嚴重的威脅[1-2]。中醫藥是中華民族的瑰寶，為中國人民的健康保駕護航幾千年，中醫藥治療可改善患者癥狀，增強機體免疫力，扶正祛邪，并可有效減輕西醫藥物化療后的不良反應，從而提高患者的生命質量[3]。肝癌在中醫上主要屬于“癥瘕”“積聚”等范疇，在治療上針對“癥瘕”“積聚”等瘀血阻滯病機多采用活血化瘀療法[4]。中藥三棱破血逐瘀，莪術活血行氣，二者配伍活血化瘀消癥，相得益彰。

《日華子本草》曰：“三棱治婦人血脈不調，心腹痛，落腰消惡血，補勞。”藥理研究證實三棱不但具有抗血栓的功效，還有溶栓的功效。莪術首載于《藥性論》，其曰“莪術能治女子血氣心痛，破痃癖冷氣”。現代藥理研究證實莪術揮發油具有殺死癌細胞的作用，莪術醇有抑瘤作用，還可以抗血栓[5-6]。三棱-莪術對于肝癌的治療作用盡管得到諸多臨床案例驗證，但目前現代藥理學對中藥三棱、莪術治療肝癌的相關作用機制研究仍不明確，尤其是在分子作用層面，故運用網絡藥理學方法，依據網絡數據庫，研究分析三棱-莪術有效成分在治療肝癌方面的機制，從而為臨床應用三棱-莪術治療肝癌以及后續相關實驗研究提供理論基礎。

資料與方法

1. 藥物成分的篩選和收集

三棱-莪術成分和靶點數據來源于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）。在TCMSP網站中查詢可以得到當三棱-莪術藥對的有效成分信息及其藥理學信息，通過藥對的吸收、分布、代謝及排泄（Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME）特性，將口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18作為依據來篩選有效成分。利用獲取三棱-莪術藥對中篩選出的每個成分對應的潛在靶點信息，利用Uniprot數據庫校正并將相關靶點轉換為基因[7]。同時運用Cytoscape 3.2.1軟件構建藥物有效成分-靶點網絡圖。

1.2 疾病靶點獲取

利用DrugBank數據庫、在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數據庫、治療靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）數據庫，檢索“liver cancer”，獲取肝癌相關靶點成分，從而構建肝癌相關靶點數據庫。

1.3 藥物與疾病關聯靶點網絡構建

通過Uniprot數據庫對獲取的靶點進行校正，統一藥物有效成分和疾病靶點信息來源，取得交集的靶點即為三棱-莪術藥對治療肝癌的作用靶點。利用String數據庫進行相互作用蛋白查詢及蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡的構建。

1.4 基因富集分析

采用DAVID數據庫對交集靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。探究三棱-莪術藥對有效成分靶點通過參與生物進程和調控信號通路來治療肝癌的分子作用機制。

2 結果

2. 三棱-莪術藥對活性成分的篩選和收集

在TCMSP數據庫中檢索三棱-莪術藥對的所有成分，依據ADME參數中OB、DL、BBB條件進行篩選，結果共篩選出49個化學成分，其中三棱有7個活性成分、莪術有42個活性成分，得到三棱-莪術藥對相應靶點蛋白539個。將三棱-莪術成分及靶點導入Cytoscape 3.2.1軟件，繪制其活性成分及靶點網絡。見圖1。圖中平均自由度為3.630，根據Degree值列出成分-靶點前15位。見表1。

2.2 PPI網絡分析

通過DrugBank數據庫以及OMIM數據庫檢索與肝癌相關基因836個基因，與三棱-莪術藥對成分靶點進行匹配，最終得到交集靶點31個。將31個交集靶點導入String數據庫獲取核心靶點PPI網絡。見圖2。

2.3 GO富集分析

將三棱-莪術藥對相關的31個靶點通過DAVID數據庫進行GO富集及通路分析。在GO富集分析中獲得125條生物過程條目，根據發現錯誤率選取其中前10位進行重點分析。其中分子功能條目3個，細胞組分條目2個，生物過程條目5個。見表2。

2.4 KEGG通路富集分析

為了進一步研究三棱-莪術藥對治療肝癌的分子作用機制，對31個核心靶點進行KEGG通路分析，并依據FDR<0.05的標準篩選出79條相關信號通路，如腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路等，結果以氣泡圖直觀展示。見圖3。將TNF信號通路中所包含的基因直觀展示。見圖4。

3 討論

肝癌歸屬于中醫學中“鼓脹”“癥瘕”等范疇[8]。《景岳全書》曰：“三棱，善破積氣，逐瘀血，消飲食飽滿，氣滯腹痛，除痃癖癥瘕，積聚結塊。”其破血行氣，尤適用于肝癌等有形實邪積聚之癥瘕腫塊。《本草經疏》載：“莪術，味苦辛，入足厥陰肝經氣分，能破氣中之血，主積聚諸氣，為最要之藥，與京三棱同用之良。”三棱莪術作為藥對同用或對比還記載于《本草新編》《醫學衷中參西錄》等醫學著作中。現代研究表明，三棱-莪術藥對在減緩細胞生長周期中有一定作用，并可抑制腫瘤細胞的產生，通過誘導腫瘤細胞凋亡而起到治療腫瘤的作用[9-11]。

本研究發現三棱的主要成分為山柰酚、異硫氰酸、三棱酸等，莪術的主要成分為1，7，7-三甲基雙環[2.2.1]庚烷-2-醇、八醛、3-（4-甲氧基苯基）丙烯酸乙酯等，治療肝癌的關鍵靶點為AKT1、TNF、IL6、ESR1、PTGS2等。超過90%的原發性肝癌為肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），HCC的預后較差。相關研究表明，PI3K/AKT/m TOR信號通路在腫瘤的發生、發展中起重要作用[12]，并對重要抑癌基因p53的表達具有關鍵調控作用[13]。AKT是PI3K/AKT信號通路中極為重要的下游效應分子，是連接作用于PI3K/AKT/m TOR信號通路的橋梁[14]。相關文獻報道，AKT包含AKT1、AKT2、AKT3 3種亞型，可介導蛋白質-蛋白質相互作用[15]。陳晶[16]研究結果顯示作用于HCC細胞增殖和遷移的主要是AKT1，阻斷AKT1能有效抑制核因子κB的表達，從而減緩肝癌的進程。TNF是可以損傷腫瘤細胞，使其壞死的物質，其中TNF-α發揮誘導細胞凋亡、調節機體免疫應答、調控腫瘤組織血管系統、誘導細胞程序性壞死等方面的功能，在肝癌的治療中具有重要的作用[17]。IL-6是一種炎癥介質，是一種單鏈糖蛋白，在免疫調節、炎癥及腫瘤發生方面具有廣泛的調控作用[18]。趙振雄[19]挖掘出癌旁成纖維細胞（Peri-tumor Fibroblasts，PTFs）促進肝癌惡性特征的關鍵作用因子IL-6，利用RayBio Human Cytokine Antibody Array檢測顯示PTFs分泌量最大的細胞因子是IL-6，顯示IL-6通路在癌旁表達較癌組織高。PTGS2是參與合成PTG類物質的一種酶，可參與炎癥、凋亡及調控腫瘤等多種生化過程[20-21]。

GO富集分析和KEGG通路分析表明，TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路是三棱-莪術藥對主要的作用通路，通過對一氧化氮生物合成過程的正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、干預類固醇激素受體活性及信號通路，從而介導炎癥反應等起到抑制腫瘤的作用。Toll樣受體4（TLR4）在全身各組織細胞中廣泛表達[22]，TLR4在肝癌細胞株Hep3B中高表達，其增殖能力隨TLR4被干擾受到明顯抑制，且TLR4于膜表面表達情況與外周血內毒素水平正相關，而內毒素對肝癌的發展起到促進作用，提示TLR4與腫瘤細胞增殖相關[23]。蘇純潔等[24]采用免疫組織化學染色法檢測90例肝癌組織中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達，結果顯示HIF-1α信號通路激活是導致肝癌組織中PD-L1表達升高的原因之一。

綜上所述，本研究綜合網絡藥理學及文獻報道，初步驗證了三棱-莪術藥對通過腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路，通過對一氧化氮生物合成過程的正調控和RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控，干預類固醇激素受體活性及信號通路，介導炎癥反應等發揮抗腫瘤生物學作用，表明三棱-莪術藥對治療肝癌是多成分、多靶點、多通路。本研究通過網絡藥理學闡明三棱-莪術藥對治療肝癌可能的靶點和分子機制，為臨床治療肝癌提供客觀依據。

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（2020-09-17收稿 本文編輯：楊覺雄）