脫細胞人羊膜支架材料對羊膜源性干細胞增殖作用的影響*

渠亞超 殷繼明 任鋒 櫻川宣男 加茂功 鮑旭麗 陳德喜 李寧 樸正福

(1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院腫瘤內科，北京 100069；2.北京市肝病研究所，北京 100069；3.日本北里大學再生醫療部門，東京 108-8641)

人羊膜位于胎盤的最內層，為厚度20～500 μm的半透明膜[1-2]，擁有優越的細胞外基質成分，被認為是天然支架中最好的材料而廣泛運用于組織工程學中[3-4]。人羊膜作為細胞載體的支架材料具有很多優點，如細胞三維結構培養、生物相容性好、可吸收性和無毒性反應等[5]，已被廣泛應用于各部位損傷修復，如角膜移植、皮膚缺損、軟骨損傷后的修復及外周神經再生等領域，并獲得良好的治療效果[6-13]。脫細胞人羊膜支架是用物理、化學、以及酶消化來破壞細胞膜和細胞之間的化學鍵，釋放出細胞內容物，以制成具有活性物質的細胞外基質生物材料。脫細胞人羊膜支架具有生物相容性好、低免疫原性等特點，富含多種細胞功能調節因子、膠原蛋白等為細胞生長提供適宜微環境[14]。羊膜細胞外基質作為一種生物材料在組織工程中的應用越來越受到重視。羊膜干細胞具有強大的更新和分化能力，李文武等[15]證實干細胞移植用于肝衰竭中能提高肝功能水平、減輕肝臟局部炎癥細胞聚集，從而緩解肝臟組織病理損傷。Shi 等[16]評估了干細胞治療HBV感染相關的慢加急性肝衰竭患者的安全性和有效性，發現干細胞靜脈輸注后可增加患者血清白蛋白和膽堿酯酶水平、凝血酶原活性以及血小板計數，同時顯著降低血清總膽紅素和轉氨酶水平，改善肝功能，減少終末期肝病模型評分，從而提高患者生存率。本研究從胎盤中分離完整的羊膜，用物理化學方法去除細胞成分制備成細胞外基質液，并用不同濃度包被培養皿，在其上培養羊膜源性干細胞，并對脫細胞人羊膜支架對羊膜來源干細胞的生長增殖作用進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 羊膜源性干細胞(hAMC-SP)分選及分離培養：取38～40周孕婦剖宮產術后羊膜，獲取胎盤事先得到知情同意。羊膜以0.125%胰酶(含1.3 mM EDTA)37oC 下消化后清除人羊膜上皮細胞(human amnion epithelial cells，hAECs)。以0.01%膠原酶及DNA酶混合液37oC繼續消化1 h，同時置振蕩器振蕩。離心后獲得的細胞即 hAMCs。準備2份hAMCs(106/mL)懸浮于DMEM(含2% FBS、10 mM HEPES)中，用5 μg/mL Hoechst 33342 (Sigma)進行細胞核染色120 min。為遮斷染料排除泵，其中1份加50 μM verapamil(維拉帕米)，作為對照。染色結束后4℃下離心(1500 rpm，5 min)。Hanks′平衡鹽溶液(含2% FBS、10 mM HEPES)重懸細胞至(2～4)×106/mL，然后加入2 μg/mL PI(Sigma)。裝備360 nm紫外激光器的EPICS ALTRA流式細胞儀(Beckman Coulter，Fullerton，CA)用于細胞篩選。Hoechst 33342及PI首先受紫外激發。其熒光發射分別利用450/20 nm 帶通濾光片(Hoechst藍色熒光信號)和675 nm 長帶濾光片(Hoechst紅色熒光信號)進行檢測。從死細胞發射出的PI熒光信號用帶通濾光片進行測定。610 nm短通型二色分光鏡用于分離這些反射波長。Hoechst的藍、紅色熒光以線性標度顯示。在這條線上顯示Hoechst熒光的為SP側群細胞，加verapamil的對照組在此區域顯示弱或消失Hoechst熒光。SP區域分選出的hAMC-SP細胞，用DMEM/F-12 (1:1) 培養皿(含10% FBS，10 ng/mL人白細胞抑制因子(LIF，CHEMICON)、10 ng/mL表皮生長因子(PeproTech)、10 ng/mL β成纖維成長因子(bFGF，Pepro Tech)、0.2 mM 2-巰基乙醇(Sigma)和脫細胞羊膜支架包被的培養皿，置于37℃、5% CO2飽和濕度的孵箱內培養。羊膜液制備：得到患者的知情同意前提下，獲得38～40周孕婦剖宮產術后的羊膜。用PBS反復清洗后把羊膜切成1～2 cm，加入0.02% EDTA溶液后反復震搖。離心后棄上清液，加入0.25 M醋酸溶液后在90℃水中緩慢搖動，直至完全溶解。經過多次離心后，上清放入至透析袋，并在水中進行反復透析。蛋白定量后低溫保存。脫細胞人羊膜支架包被培養皿制備：選擇96孔板，在里面鋪平羊膜液，以0.5～1.5 mg蛋白量/cm2面積鋪培養板(根據280/260 OD值決定)。根據羊膜液濃度不同設置低濃度組、中濃度組及高濃度組。包被培養皿進行紫外線照射(離培養皿15 cm，15 w UV強度照射15 min)，并保存在冷藏環境下(保存時間不超過一年)。用類似的方法制備0.9%生理鹽水包被培養皿作為對照組、人細胞外基質(HEM)(BD Biosciences，USA)培養皿及膠原蛋白I(足鍵，Iwaki，Japan)培養皿。蛋白質濃度利用Quick Start Bradford Dye Reagent (Bio Rad，USA)檢測。

1.2 羊膜干細胞增殖活性檢測 羊膜源性干細胞(hAMC-SP)3500～4500個/cm2鋪平24孔培養皿，對照組及每個實驗組均設置3個重復平行孔(n=3)，且做了3次重復同樣實驗。置于37℃、5% CO2，飽和濕度的孵箱內培養。不同的時間用EDTA-胰酶溶液進行消化，并PBS洗滌后用于測定。羊膜干細胞增殖活性用CCK-8細胞計數試劑盒 (Dojindo，Japan)進行檢測。

1.3 統計學分析 采用SPSS 11.0統計軟件進行分析，兩樣本間比較采用校正t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hAMC-SP培養情況 羊膜干細胞在脫細胞人羊膜支架包被培養皿上在37℃，5% CO2下進行培養2～3天后細胞粘附在培養皿底面，更換培養液，以清除未貼壁細胞。顯微鏡下觀察其生長情況，每3天換液，細胞長滿后用膠原酶-EDTA消化進行傳代培養。 hAMC-SP大部分1～3天內貼壁，細胞呈現梭性或星性，此時細胞呈現單個分散或幾個細胞克隆。培養一周后細胞增殖速度明顯，發生形態變化，呈寬大扁平，細胞成群。免疫細胞化學分析，hAMC-SP細胞表達Vimentin、Nestin、Musashi-1等神經干細胞特異性標記蛋白，也表達Flt-1、Integrin β及HNF等肝干細胞分化相關蛋白[17]。在脫細胞人羊膜支架材料包被培養皿上培養的細胞與其他包被生物材料相比，粘附快、排列整齊均勻、未貼壁細胞很少、增殖速度明顯加快，見圖1。

圖1 羊膜干細胞在脫細胞人羊膜支架材料包被培養皿上生長情況(100×) Figure 1 Growth of amniotic membrane stem cells on a culture dish coated with acellular amniotic membrane scaffold

2.2 hAMC-SP在脫細胞人羊膜支架包被培養皿上培養情況 不同濃度(低濃度0.5 mg/cm2、中濃度1.0 mg/cm2、高濃度1.5 mg/cm2)的脫細胞人羊膜支架包被培養皿上hAMC-SP的生長增殖速度顯示不一樣，包被濃度越高細胞生長速度越快，提示脫細胞人羊膜支架材料對羊膜源性干細胞的增殖具有明確促進作用。培養0天時，各組間無統計學差異(P>0.05)。培養4天時，對照組與不同濃度組之間細胞增殖速度出現顯著性差異(均P<0.05)，且細胞增殖速度在低和中濃度組之間、中和高濃度組之間均有顯著性差異(P=0.029及0.022)，提示羊膜支架材料對早期的細胞增殖速度影響明顯。培養8天時，對照組與其它三組不同濃度之間仍然差異顯著(均P<0.05)。低、中濃度組與高濃度組之間有顯著性差異(均P<0.05)。培養12天時，對照組與低、中及高濃度之間細胞數有顯著性差異(均P<0.05)，且低濃度組與中、高濃度組之間均有顯著性差異(P=0.049及0.029)。提示隨著培養時間進一步延長，細胞增殖速度仍明顯受到羊膜支架材料濃度的影響，見圖2。

圖2 不同濃度羊膜支架材料包被培養皿上細胞增殖活性分析Figure 2 Analysis of cell proliferation activity on culture dishes coated with different concentrations of amniotic membrane scaffold materials注：培養4、8、12天時，對照組與不同濃度組之間細胞增殖速度出現顯著性差異，不同濃度之間也出現增殖速度的差異。平均增殖細胞數用OD值表示(每次3個細胞孔，重復3次實驗)

2.3 hAMC-SP在不同生物材料包被培養皿上培養 把hAMC-SP在對照組、膠原蛋白I組、脫細胞人羊膜支架及人細胞外基質(HEM)等生物材料包被培養皿上進行培養，以此比較羊膜來源干細胞在不同生物材料包被培養皿的生長情況(圖3A)。結果脫細胞人羊膜支架材料包被培養皿上干細胞增殖速度與其他三組相比，差異存在顯著性(均P<0.05)(圖3B)。膠原蛋白I組與HEM組之間無顯著性差異(P=0.127)。

圖3 hAMC-SP在不同生物材料包被培養皿上培養Figure 3 Amniotic membrane-derived stem cells were cultured on different biomaterial-coated culture dishes注：A.羊膜源性干細胞在不同生物材料包被培養皿上進行培養8天結果(100×)；B.各種生物材料包被培養皿中羊膜源性干細胞的培養。培養8天后的平均增殖細胞數(OD值)(每次3個細胞孔，重復3次實驗)。①P<0.05

3 討論

在組織工程領域，支架材料是不可或缺的環節。理想的提供細胞種植的基質材料應具有以下特點：無毒性、良好的生物組織相容性、生物可降解性及降解可調節性，同時不引起機體的免疫排斥反應，具有可塑性和一定的機械強度以及良好的表面活性等[18-19]。羊膜的生物學特性是羊膜成為理想供體材料的物質基礎。1910年胎膜第一次被成功地用作皮膚移植的供體材料后[20]，羊膜作為一種生物材料受到廣泛注目。羊膜位于胎盤的最內層，其光滑，無血管、神經及淋巴，無免疫原性。

1980年Kari等[21]分析了人羊膜上皮細胞在進行原代培養時所產生的細胞外基質的組成，其成分主要為兩種基質蛋白，即纖維結合蛋白和Ⅲ型溶膠原蛋白，還有少量的層粘連蛋白IV型和AB型基膜膠原。羊膜溶液化后的成份鑒定提示，加工處理后的羊膜具有結構和功能性的基質特征[22]。華萍等[23]發現凍干羊膜或新鮮羊膜均具有良好的組織相容性，不會引起明顯的急性免疫排斥反應，作為異體移植材料免疫安全性較好。人羊膜支架不僅具有安全性，同時含有促進細胞增殖的成分。有研究證實人羊膜含有纖維黏連素、Ⅳ型膠原及大量硫酸乙酰肝素蛋白多糖，以及其它一些蛋白多糖大分子和神經營養因子。Enosawa等[24]發現人羊膜上皮細胞不僅表達神經細胞的特異性蛋白，而且還合成和分泌多種神經營養因子及神經遞質。這可能與促進細胞增殖相關。楊繼濱等[25]研究發現人脫細胞羊膜支架能夠有效促進人羊膜間充質細胞黏附，并且未發現排斥反應及毒性。日本學者把羊膜作為一個基質，在羊膜上進行了胚胎干細胞的培養，并誘導成神經細胞[26]。作為肝病大國，終末性肝病的治療中干細胞移植越來越受到矚目，干細胞的分離和體外培養，維持它的干性特征的實驗室研究具有重要意義。

在前期研究中我們從人羊膜成功分離干細胞，并對其生物學特性進行了一系列的鑒定，它表達Oct-4、Sox-2及Rex-1等干細胞標記物，但它不表達CD34、CD45等造血干細胞標記分子[18]，具有間充質干細胞表面抗原特征。在本研究中我們成功制備了脫細胞人羊膜支架包被培養皿，并把羊膜中分離的干細胞在包被培養皿上進行了培養，以此探討羊膜支架對干細胞增殖速度的影響。結果提示與未處理過的普通培養皿相比，羊膜源性干細胞在羊膜支架材料包被的培養皿上增殖率明顯增加，且濃度越高其增殖速度越快，呈線性正相關性。去除細胞后的羊膜支架材含有各種類型的膠原纖維、纖維連接蛋白、整合素及層粘連蛋白等分子，這些成分的存在對細胞的生長提供三維空間結構，促進各種細胞的粘附，有利于細胞快速生長。本研究結果也證明了脫細胞人羊膜支架材料對成體干細胞具有促進粘附和增殖作用。羊膜作為廉價的生物材料，將為細胞的體外培養、胚胎及成體干細胞的生物學特性研究，以及再生醫學的眾多領域中發揮重要的作用。

本研究的另一個實驗結果表明，脫細胞羊膜支架與傳統的膠原纖維及人細胞外基質材料比較，具有更明顯的促進細胞增殖生長的作用，提示羊膜支架材料有著更廣闊的基礎與臨床應用研究價值。來自動物的膠原蛋白包被的培養皿等可能含有動物來源的抗原成分，細胞培養后移植治療時引起免疫反應，在生物醫學研究中具有一定的局限性和風險因素，因此再生醫學領域中人來源的生物材料具有更重要的意義。細胞外基質除了生物支架作用外，還對各種干細胞的粘附、分化、發育及移行等表現具有及其深遠影響，其分子作用機制有待進一步摸索和探討。本實驗中對培養后干細胞的活性及功能未進行進一步的檢測和分析，需要下一步繼續探討。

各種組織中提取的干細胞在培養時發現，與空白對照組相比在某些細胞外基質包被培養皿上干細胞呈現較好的黏附，增殖生長速度加快、移行等特點，可以迅速增殖到足夠細胞數量以用于移植治療。但來自動物的膠原蛋白、纖維蛋白等生物材料包被的培養皿等可能含有動物來源的抗原成分，細胞培養后移植治療時易引起免疫反應。而脫細胞人羊膜支架材料具有來源廣泛、容易制備、易于保存、不涉及倫理問題及無免疫排斥反應等特點，作為一種特殊的細胞外基質和生物載體，在再生醫學研究領域中具有極其廣闊的應用前景。

4 結論

脫細胞人羊膜支架材料有望成為干細胞研究與再生醫療領域中的新型生物材料。