子宮平滑肌肉瘤組織EphA2/EphrinA1表達及沉默EphA2對腫瘤細胞生長與RelA/p65磷酸化的影響*

鄧卉 陳曉燕 嚴園 魏征 肖鳳蓮 余曉

(1. 重慶市中醫(yī)院婦科，重慶 400011；2. 重慶市九龍坡區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，重慶 400051)

子宮平滑肌肉瘤是較罕見的婦科泌尿生殖道惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，僅有2%～5%的子宮惡性腫瘤是子宮平滑肌肉瘤，但由于其侵略性較強，且治療方法有限，因此死亡率較高[1-3]。生促紅素肝細胞受體A2(Erythropoietin-producing hepatocyellular receptor A2，EphA2)屬于受體酪氨酸激酶超家族中最大的亞家族-Eph受體，EphA2及其配體EphrinA1與多種惡性腫瘤的形成和進展相關(guān)，兩者在腫瘤細胞中存在過表達的現(xiàn)象[4-5]，且還有研究表明EphA2表達的增加與患者預后不良以及腫瘤轉(zhuǎn)移也相關(guān)[6]。鑒于此，本研究通過檢測EphA2和EphrinA1在子宮平滑肌肉瘤中是否存在異常表達，進而利用siRNA技術(shù)沉默EphA2表達以觀察其對子宮平滑肌肉瘤細胞生物學行為和RelA/p65磷酸化的影響，以期為子宮平滑肌肉瘤的靶向治療及預后評估的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月～2020年6月在重慶市中醫(yī)院婦科診治的子宮平滑肌肉瘤患者共28例作為研究對象，收集術(shù)中切除的子宮平滑肌肉瘤樣本，對照組為子宮平滑肌瘤組織包膜外正常肌層，即為瘤旁組織。此次研究獲得了本院倫理委員批準進行，研究的所有患者均簽署了知情同意書。患者年齡 34～54歲，平均(45.47±4.62)歲。所有患者符合子宮平滑肌瘤的診斷標準，以影像學診斷為依據(jù)；術(shù)前均未經(jīng)放、化療及服用激素藥物治療；均無卵巢腫瘤、糖尿病等并發(fā)癥；臨床和隨訪資料完整。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色檢測組織中EphA2與EphrinA1表達 取手術(shù)切除的子宮平滑肌肉瘤及瘤旁組織，置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切取5 μm厚的切片。取切片放置在烤箱中66℃處理1 h，接著在二甲苯中脫蠟，梯度酒精脫水，PBS沖洗3次，每次5 min；加入檸檬酸鈉進行抗原修復，PBS沖洗3次，每次5 min；取0.3%過氧化氫液滴于切片上，室溫孵育10 min；采用10%山羊血清封閉，滴加稀釋的一抗(1:100)，4℃孵育過夜。第二天，PBS沖洗后，滴加生物素標記二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，流水沖洗干凈，蘇木精復染，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察組織中陽性表達并捕獲圖像，胞質(zhì)染成黃色至棕色即為陽性，隨機選擇6個視野，Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計陽性表達面積。

1.3.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測EphA2、EphrinA1mRNA表達 Trizol法提取不同組織及各處理組細胞總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA質(zhì)量與濃度。選擇符合要求的RNA樣品，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，接著以cDNA為模板，通過實時熒光定量檢測系統(tǒng)檢測EphA2、EphrinA1mRNA表達，具體實驗步驟按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行，選擇β-actin作為內(nèi)參基因。擴增程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s(循環(huán)40次)。擴增結(jié)束后，運用2-ΔΔCt法計算基因的表達水平，引物序列如下：EphA2上游引物5′-TCAGCAGCAGCGACTTCGAGGCA-3′，下游引物5′-GCCATGAAGTGC TCCGTAT -3′；EphrinA1上游引物5′-AACAAGCTGTGCAGGCATGG-3′，下游引物5′-CTCCACAGATGAGGTCTTGC-3′；β-actin上游引物 5′-ATGGTGGGAATGGGTCAGA-3′，下游引物 5′-TCTCCATGTCAGCCAGTTG-3′。

1.3.3 細胞復蘇與培養(yǎng) 將凍存的SK-UT-1細胞取出，放入37℃水浴加熱，快速搖動使其完全溶解后，以800 rpm離心5 min，除去上清液，加入適量含10%一級胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天貼壁后換液，融合達到80%左右時，傳代，加入0.25%胰酶消化液消化處理，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 細胞分組與轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)良好的SK-UT-1細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL并接種于96孔板，將細胞隨機分為空白對照組、陰性對照組(NC-siRNA)、EphA2-siRNA組3組。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，分別配制EphA2-siRNA及陰性對照NC-siRNA與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000復合物，在對應(yīng)組的細胞中加入適量復合物進行轉(zhuǎn)染，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，棄去培養(yǎng)液，換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用qRT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.3.5 Western blot檢測EphA2與RelA/p65磷酸化位點蛋白表達 在各組SK-UT-1細胞中加入預冷RIPA緩沖液進行裂解，以4000 rpm離心15 min，提取各組樣品總蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度。取40 μg各組蛋白樣品等量上樣，經(jīng)過10% SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；TBST洗膜3次，每次5 min；加入兔抗EphA2(1:1000)、p53(1:1000)、RelA/p65 Ser536(1:1000)及RelA/p65 Ser276(1:1000)一抗工作液，4℃孵育過夜；第二天，棄去一抗，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(1:5000)，室溫孵育1 h；TBST再次洗膜，滴加ECL試劑液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶圖像，Image J軟件分析各條帶的灰度值，并以β-actin作為內(nèi)參蛋白來計算目的蛋白表達水平。

1.3.6 CCK-8檢測細胞增殖 取生長狀態(tài)良好的各組SK-UT-1細胞，調(diào)整密度為5×55個/ml，吸取100μl接種于96孔板，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱過夜。次日，進行細胞轉(zhuǎn)染處理實驗，在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，分別于每孔加10 μl 的CCK-8，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，通過全自動酶標儀檢測各孔細胞在450 nm處的光密度(OD)值。

1.3.7 Transwell小室實驗檢測細胞遷移與侵襲 采用DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel膠，取50 μL稀釋的Matrigel膠加入Transwell小室上室聚碳脂膜上，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)干燥。取轉(zhuǎn)染后各組SK-UT-1細胞，調(diào)整密度為2×104個/ml，取200 μL細胞懸液加入小室上室，并在下室中加入600 μL無血清DMEM培基液，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育24 h，取出小室，棄去培養(yǎng)液，用濕棉簽輕輕擦去上室細胞，下室室面用4%多聚甲醛中固定30 min，擦去固定液，加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，流水洗掉多余染液，在光學顯微鏡下隨機選擇6個視野觀察并捕獲圖像，統(tǒng)計侵襲細胞數(shù)目，取平均值為實驗結(jié)果，實驗重復3次。遷移實驗除不進行鋪膠外，其他操作均與上述過程一致。

風選系統(tǒng)正常運轉(zhuǎn)后，可提高商品煤品類精度，但相應(yīng)的排矸量也相應(yīng)增加，勢必減少商品煤總量，這就需要進行項目經(jīng)濟性對比分析，從而佐證項目經(jīng)濟性和可行性。經(jīng)對風選實驗時商品煤質(zhì)量情況進行測定，結(jié)合市場價格情況和具體資金投入等進行綜合分析計算，來測算項目的經(jīng)濟效益。

1.3.8 TUNEL染色檢測細胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染后的各組SK-UT-1細胞，PBS沖洗3次，每次5 min，加入4%多聚甲醛固定細胞30 min，加入含0.3% Triton X-100的PBS重懸細胞，室溫下繼續(xù)孵育5 min，接著加入TUNEL檢測液，反復吹打混勻，置于37℃避光孵育1 h，PBS洗滌細胞，進行涂片處理后，在熒光顯微鏡觀察隨機選擇6個視野，計數(shù)細胞總數(shù)目和TUNEL陽性染色細胞數(shù)目，計算TUNEL陽性率。

1.3.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染后的各組SK-UT-1細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS沖洗3次，每次5 min，以4000 rpm離心10 min，棄去上清液，用適量染色緩沖液binding buffer中調(diào)整細胞密度為 1×106個/mL，吸取100 μL細胞懸液，依次加入10 μL Annexin V-FITC試劑液與5 μL PI溶液，混合均勻，避光室溫孵育15 min，立即上流式細胞儀檢測各處理組細胞凋亡發(fā)生的比例。

1.3.10 免疫熒光染色檢測NF-κB p65表達 收集轉(zhuǎn)染后的各組SK-UT-1細胞，PBS沖洗3次，每次5 min，加入4%多聚甲醛固定15 min，滴加含有0.5%TritonX-100的PBS通透處理15 min，PBS再次清洗；采用10%山羊血清封閉細胞2 h，接著加入稀釋的兔抗p65抗體(1:200)，4℃孵育過夜；第2天，PBS洗滌后，滴加FITC標記的熒光二抗(1:250)，室溫避光孵育1 h，采用DAPI避光孵育5 min染核，PBS洗滌細胞，使用熒光顯微鏡觀察并捕獲圖像。

2 結(jié)果

2.1 子宮平滑肌肉瘤及癌旁組織中EphA2與EphrinA1表達比較 免疫組織化學染色結(jié)果所示，EphA2與EphrinA1在子宮平滑肌肉瘤組織中陽性染色較深且面積較多，而兩者在癌旁組織中陽性染色面積較少，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，子宮平滑肌肉瘤組織中的EphA2與EphrinA1 mRNA相對表達量均顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 免疫組化染色檢測組織EphA2與EphrinA1表達(100×)Figure 1 Immunohistochemical staining to detect the expression of EphA2 and EphrinA1 in tissues

圖2 qRT-PCR檢測組織EphA2、EphrinA1 mRNA表達Figure 2 qRT-PCR detection of tissue EphA2，EphrinA1 mRNA expression

2.2 轉(zhuǎn)染后子宮平滑肌肉瘤細胞中EphA2表達變化 qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染48 h后，EphA2-siRNA組SK-UT-1細胞中EphA2 mRNA與蛋白的相對表達量較空白對照組均顯著下調(diào)(P<0.05)，而EphA2-siRNA組和EphA2-NC組的EphA2 mRNA與蛋白相對表達量之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 qRT-PCR和Western blot檢測各組SK-UT-1細胞中EphA2 mRNA及蛋白表達Figure 3 qRT-PCR and Western blot detection of EphA2 mRNA and protein expression in SK-UT-1 cells of each group

2.3 沉默EphA2表達對子宮平滑肌肉瘤細胞增殖的影響 CCK-8檢測沉默EphA2表達后對SK-UT-1細胞增殖活性的影響，檢測結(jié)果顯示，相較于空白對照組，EphA2-siRNA組細胞在轉(zhuǎn)染24、48及72 h后，細胞的增殖活性顯著下降(P<0.05)，而NC-siRNA組與空白對照組的細胞增殖活性之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖4 CCK-8檢測各組SK-UT-1細胞增殖活性Figure 4 CCK-8 detects the proliferation activity of SK-UT-1 cells in each group注：與Blank組比較，①P<0.05

2.4 沉默EphA2表達對子宮平滑肌肉瘤細胞遷移與侵襲的影響 Transwell小室實驗檢測沉默EphA2表達對SK-UT-1細胞遷移與侵襲的影響，見圖5。與空白對照組比較，EphA2-siRNA組細胞的遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均顯著減少(P<0.05)，而NC-siRNA組細胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均無顯著變化(P>0.05)。

圖5 Transwell小室實驗檢測各組SK-UT-1細胞遷移與侵襲Figure 5 Transwell chamber experiment to detect the migration and invasion of SK-UT-1 cells in each group

2.5 沉默EphA2表達對子宮平滑肌肉瘤細胞凋亡的影響 TUNEL染色檢測結(jié)果所示，三組SK-UT-1細胞中均有陽性染色，與空白對照組比較，EphA2-siRNA組TUNEL陽性染色細胞率顯著增加(P<0.05)，NC-siRNA組TUNEL陽性染色細胞率則無顯著變化(P>0.05)，見圖6。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，EphA2-siRNA組SK-UT-1細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，而NC-siRNA組和空白對照組的細胞凋亡率之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖7。

圖6 TUNEL染色檢測各組SK-UT-1細胞凋亡Figure 6 TUNEL staining to detect the apoptosis of SK-UT-1 cells in each group

圖7 流式細胞術(shù)檢測各組SK-UT-1細胞凋亡Figure 7 Flow cytometry detection of SK-UT-1 cell apoptosis in each group

2.6 沉默EphA2表達對子宮平滑肌肉瘤細胞p65表達的影響 免疫熒光染色結(jié)果所示，空白對照組SK-UT-1細胞中p65在核中染色明顯，綠色熒光強，NC-siRNA組細胞中p65核染色也較明顯，綠色熒光強度與空白對照組相似，而EphA2-siRNA組染色較空白對照組變淺，核內(nèi)無明顯綠色熒光表達，見圖8。

圖8 免疫熒光染色檢測各組SK-UT-1細胞p65表達(100×)Figure 8 Immunofluorescence staining to detect p65 expression of SK-UT-1 cells in each group

2.7 沉默EphA2表達對子宮平滑肌肉瘤細胞RelA/p65磷酸化水平的影響 Western blot檢測SK-UT-1細胞中RelA/p65主要活性位點的磷酸化水平，與空白對照組比較，EphA2-siRNA組細胞中p53蛋白表達顯著升高(P<0.05)，RelA/p65 Ser536和RelA/p65 Ser276磷酸化蛋白水平顯著降低(P<0.05)；而空白對照組和NC-siRNA組以上各蛋白水平表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖9。

圖9 Western blot檢測各組SK-UT-1細胞中RelA/p65磷酸化位點蛋白表達Figure 9 Western blot detection of RelA/p65 phosphorylation site protein expression in SK-UT-1 cells in each group

3 討論

子宮平滑肌肉瘤是一種較為罕見的腫瘤，由于臨床表現(xiàn)與普通肌瘤相似，因此檢測及治療困難。目前，子宮平滑肌肉瘤的治療手段包括全腹子宮切除術(shù)、雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)和使用化療藥物，但患者3年無進展生存率僅為50%。大多數(shù)患者在治療后8～16個月內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)，通過血流轉(zhuǎn)移至別處器官，多數(shù)復發(fā)發(fā)生在骨盆外區(qū)域，肺是最常見的復發(fā)部位[7-9]。導致子宮平滑肌肉瘤的發(fā)生發(fā)展的尚不清楚，研究表明，在子宮平滑肌肉瘤中涉及了一些基因突變或者表達改變，通過全面的基因組分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種基因的改變，鑒別這些特異性基因蛋白在開發(fā)新型針對子宮平滑肌肉瘤的分子靶向療法中起著十分關(guān)鍵的作用。

Eph受體構(gòu)成了一個較大的受體酪氨酸激酶家族，其能夠通過與聚集在鄰近細胞中的Ephrin配體結(jié)合，從而介導細胞之間信號傳遞過程。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)EphA2在多種腫瘤組織或細胞中存在過表達現(xiàn)象，并與其配體EphrinA1結(jié)合參與調(diào)控腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、體液穩(wěn)態(tài)以及血管重組等過程[4，10]。本研究結(jié)果顯示，EphA2與EphrinA1在子宮平滑肌肉瘤組織中的表達水平明顯高于瘤旁組織中的表達水平，這提示EphA2及其配體EphrinA1可能參與了子宮平滑肌肉瘤的發(fā)生發(fā)展。在以往研究中，李黎等[11]通過檢測發(fā)現(xiàn)在宮頸鱗癌組織中EphA2和EphrinA1呈高表達，且兩者表達水平均與宮頸鱗癌的腫瘤分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部侵潤深度相關(guān)。Shao等[12]研究發(fā)現(xiàn)EphA2/EphrinA1在涎腺腺樣囊性癌中高表達，與微血管密度、臨床TNM分期、神經(jīng)周浸潤和血管浸潤相關(guān)，表明了EphA2/ EphrinA1可以作為腺樣囊性癌的新型治療靶點。以上結(jié)果說明EphA2及其配體EphrinA1在多種腫瘤中存在異常高表達，并與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

Eph受體家族由兩個亞類EphA(EphA1-10)和EphB(EphB1-6)組成。研究發(fā)現(xiàn)，EphA2作為該家族成員之一，能夠促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性生物學過程，其過度表達也與乳腺癌、胃癌、宮頸癌、膀胱癌、鼻咽癌等發(fā)生發(fā)展以及患者不良預后之間均密切相關(guān)[13-18]。考慮到以EphA2為靶點的治療方法在臨床治療中的應(yīng)用，本研究通過脂質(zhì)體介導法將EphA2-siRNA轉(zhuǎn)染至子宮平滑肌肉瘤SK-UT-1細胞以沉默EphA2表達。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的增殖活性明顯下降，細胞遷移與侵襲能力均受到抑制，同時，促進了細胞凋亡的發(fā)生。因此推測，以EphA2為靶點的療法應(yīng)用于以EphA2表達作為生物標記物的腫瘤進行治療時，可能會為子宮平滑肌肉瘤患者帶來臨床益處。

NF-κB是一個普遍存在與表達的轉(zhuǎn)錄因子家族，可參與調(diào)節(jié)細胞生長、存活、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥相關(guān)基因的表達[19-22]。NF-κB信號傳導途徑在兩層反應(yīng)中被激活，IKKB的IKK依賴性磷酸化和降解可以使NF-κB發(fā)生核易位，但核易位和DNA結(jié)合不足以發(fā)揮其最大的轉(zhuǎn)錄活性，需要進行復雜的翻譯后修飾來調(diào)節(jié)其反式激活潛力[23]。RelA/p65是NF-κB家族中最重要的亞基，其磷酸化是關(guān)鍵的翻譯后激活機制。迄今為止，在RelA/p65中已經(jīng)鑒定出總共12個磷酸化位點，包括9個絲氨酸和3個蘇氨酸位點，其中Ser276和Ser536是RelA/p65中的兩個重要的磷酸化位點[24]。Ser276被蛋白激酶A和MSK1磷酸化；而Ser536被IκB激酶、TANK結(jié)合激酶(TBK1)和核糖體亞基激酶-1(RSK1)磷酸化。RelA/p65一些相關(guān)位點的磷酸化激活可能有助于腫瘤發(fā)生發(fā)展[25]。本研究結(jié)果顯示，在沉默EphA2后子宮平滑肌瘤細胞中RelA/p65 Ser536和RelA/p65 Ser276磷酸化蛋白水平均降低，而抑癌因子p53蛋白表達則升高。由此推測，沉默EphA2可能抑制了RelA/p65相關(guān)位點的磷酸化，以阻礙腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移。

4 結(jié)論

在子宮平滑肌肉瘤組織中EphA2及其配體EphrinA1均呈現(xiàn)高表達，沉默EphA2表達可抑制子宮平滑肌肉瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移，誘導細胞凋亡，并調(diào)控RelA/p65中Ser276和Ser536位點磷酸化水平。這說明兩者聯(lián)合檢測有助于子宮平滑肌肉瘤的診斷與預后評估，可為今后子宮平滑肌肉瘤的靶向治療提供新思路。