基于HPLC-ICP-MS的藏藥佐塔汞、砷元素形態、價態分析及安全性評價

海來約布，群 培，盧君蓉，蔣敏桃，文 陽，馬 權，蓋榮銀，李文兵，劉 圓

基于HPLC-ICP-MS的藏藥佐塔汞、砷元素形態、價態分析及安全性評價

海來約布1, 2, 3，群 培1, 4#，盧君蓉5，蔣敏桃5，文 陽1, 2, 3，馬 權1, 2, 3，蓋榮銀6，李文兵2, 3*，劉 圓2, 3, 7*

1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610225 2.四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，四川 成都 610225 3.青藏高原民族藥用資源保護與利用國家民委重點實驗室，四川 成都 610225 4.西藏甘露藏藥股份有限公司，西藏 拉薩 850000 5.成都中醫藥大學，四川 成都 611137 6.島津企業管理（中國）有限公司，四川 成都 611900 7.西南民族大學民族醫藥研究院，四川 成都 610041

對藏藥佐塔中汞、砷元素形態和價態進行分析，并結合其在復方制劑中用法用量進行安全性評價，以期為佐塔臨床應用提供理論依據。采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICP-MS）法測定佐塔在人工胃腸液汞、砷的形態和價態，并根據佐塔在藏藥復方制劑中用法用量來計算可溶性汞、砷的攝入量。9批佐塔在人工胃腸液中以無機汞（Hg2+）、三價砷（AsIII）和五價砷（AsV）形式存在，其質量分數分別為11.25～725.13、6.68～67.53、36.06～289.03 μg/g，未檢測出甲基汞（MeHg）、乙基汞（EtHg）、砷膽堿（AsC）、砷甜菜堿（AsB）、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）。根據佐塔在藏藥復方制劑最大日服量0.2 g計算，可溶性Hg、As的攝入量分別在2.3～145.0 μg和10.6～63.4 μg，在規范使用情況下，具有較高的臨床安全性。

藏藥；佐塔；汞；砷；價態；形態；攝入量；安全性評價

佐塔又稱佐太、佐臺，是以水銀和硫黃為原料，輔以金、銀、鐵等8種金屬與黃銅礦、銀礦石、磁石等8種礦物及多種專用輔料煉制而成[1]，是藏藥復方制劑中重要佐劑，被譽為“藏藥之母本”“藏藥寶中寶”。佐塔單用具有滋補強身、延年益壽、解毒排毒和活血、補血等功效，與其他藏藥合用具有增效解毒作用[2-3]。由于佐塔制備過程中以水銀為主要原料，并加入一定量的金屬類和珍寶類藏藥材，使其Hg、As等重金屬及有害元素含量超標，其臨床使用安全性問題一直是備受關注的焦點，也在一定程度影響了佐塔及其復方制劑的應用和推廣。

現代研究表明，重金屬及有害元素的毒性與其在機體內存在的化學形態密切相關[4]。如有機Hg因其具有親脂性和生物放大效應，毒性大于無機Hg，其中生物毒性以甲基汞（MeHg）最大[5]；而無機As由于可溶性和遷移性更高，其毒性大于有機As，毒性由大到小依次為砷化氫（AsH3）＞三價砷（As III）＞五價砷（AsV）＞一甲基砷（MMA）＞二甲基砷（DMA）＞砷膽堿（AsC）＞砷甜菜堿（AsB）＞單質砷（As）[6]。因此，模擬人體胃腸環境，對佐塔中Hg和As的形態和價態進行研究，并結合其在藏藥復方制劑使用量進行安全性風險評價，可為佐塔臨床應用安全性提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20Ai型高效液相色譜儀、2030型電感耦合等離子體質譜儀，日本島津公司；ME204E型電子天平，十萬分之一，Mettler Toledo公司；SHA-C型水浴恒溫搖床器，常州億能實驗儀器廠；1810A型摩爾原子型超純水器，上海摩勒科學儀器有限公司；KQ5200DB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C型PH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 試劑 胃蛋白酶（批號202003181）、胰酶（批號20203091）購于成都艾科達化學試劑有限公司；硝酸、鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為優級純；乙酸銨、-半胱氨酸、磷酸二氫銨、乙二胺四醋酸二鈉均為分析純，水為超純水；人工胃液和人工腸液按照《中國藥典》2020年版四部通則0921配制。

1.2.2 標準物質 MeHg溶液標準物質［批號GBW08675，（76.3±2.9）μg/g］、乙基汞（EtHg）溶液標準物質［批號GBW（E）081524，（73.8±2.7）μg/g］、MMA溶液標準物質［批號GBW08668，（46.2±1.5）μg/g］、DMA溶液標準物質［批號GBW08669，（0.706±0.024）μmol/g］、AsB溶液標準物質［批號GBW08670，（92.2±2.7）μg/g］、AsC溶液標準物質［批號GBW08671，（91.6±3.7）μg/g］均購于中國計量科學研究院；Hg元素標準物質（批號GSB- 04-1729-2004，1000 μg/mL）購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；As元素標準物質（批號BWJ4223-2016，1000 μg/mL）購于北京世紀奧科生物技術有限公司；AsIII（批號158241-1，以As計，75.7 μg/g）、AsV（批號144014-6，以As計，17.5 μg/g）購于美國O2Si公司。

1.2.3 樣品 不同批次佐塔樣品（編號為ZT0901、ZT0902、ZT0903、ZT0904、ZT0905、ZT0906、ZT0907、ZT0908、ZT0909）分別由甘孜藏族自治州藏醫院、西藏自治區藏醫院、甘南藏族自治州藏醫院、德格縣藏醫院、德格縣宗薩藏醫院、青海省藏醫院、青海久美藏醫院、青海塔爾寺藏醫院、阿壩藏族羌族自治州藏醫院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 Hg形態 Shim-pack GlST C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.01 mol/L乙酸銨溶液（含0.12%-半胱氨酸，氨水調節pH值至7.5）（8∶92）；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃。在選定條件下，3種不同形態Hg的分離度均大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 不同形態Hg混合溶液(A)、佐塔樣品(B) 和空白溶液(C) 的HPLC圖

2.1.2 As形態 Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；流動相為0.025 mol/L磷酸二氫銨溶液（氨水調節pH值至8.0）-水，梯度洗脫：0～15 min，100%～0水；15～20 min，0～100%水；20～25 min，100%水；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃。在選定條件下，6 種不同形態As的分離度均大于1.5，色譜圖見圖2。

2.2 質譜條件

高頻功率1.20 kW，高頻頻率27.12 MHz，輔助氣體積流量1.10 L/min，炬管類型Mini炬管，霧化室旋流，等離子體氣體積流量9.0 L/min，載氣體積流量0.70 L/min，碰撞氣種類He氣，采樣深度5.0 mm，霧化室溫度0 ℃（Hg）、5 ℃（As），能量過濾器電壓5.0 V（Hg）、7.0 V（As），監測質量數202Hg和75As。

圖2 不同形態As混合溶液(A)、佐塔樣品(B) 和空白溶液(C) 的HPLC圖

2.3 對照品溶液制備

2.3.1 不同形態Hg混合標準溶液 分別精密稱取MeHg、EtHg、Hg2+標準溶液適量，加8%甲醇制成各含0.1 μg/mL（以Hg計）的混合溶液，用8%甲醇分別稀釋制成0.5、1、2、5、10、20 ng/mL（以Hg計）的系列溶液。同法制備空白溶液。

2.3.2 不同形態As混合標準溶液 分別精密稱取AsC、AsB、AsIII、DMA、MMA、AsV標準溶液適量，加水制成各含2.0 μg/mL（以As計）的混合溶液，以0.02 mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液稀釋成各含1、5、10、20、50、200、500 ng/mL（以As計）的系列溶液。同法制備空白溶液。

2.4 供試品溶液制備

2.4.1 Hg形態供試品溶液 取佐塔粉末約60 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人工胃液或人工腸液250 mL，密塞，稱定質量，置37 ℃水浴中超聲處理（功率300 W、頻率45 kHz）2 h，放冷，再稱定質量，用人工胃液或人工腸液補足減失的質量，搖勻，靜置24 h，吸取中層溶液適量，濾過，精密量取續濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2 As形態供試品溶液 取佐塔粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人工腸液250 mL，密塞，稱定質量，置37 ℃水浴中超聲處理（功率300 W、頻率45 kHz）2 h，放冷，再稱定質量，用人工腸液補足減失的質量，搖勻，靜置24 h，吸取中層溶液適量，濾過，精密量取續濾液5 mL，置50 mL量瓶中，加0.02 mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 線性關系及定量限考察

分別精密吸取不同質量濃度Hg、As混合標準溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，按相應色譜和質譜條件測定峰面積。以Hg、As各形態質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，計算回歸方程。結果表明，3種Hg元素形態在0.5～20 μg/L，6種As元素形態在1～500 μg/L線性關系均良好，值均大于0.999 0。采用逐級稀釋法對Hg、As標準溶液進行稀釋，以信噪比（/）為10時相對應質量濃度為定量限，結果3種形態Hg定量限為0.08～0.11 μg/L；6種形態As定量限為0.09～0.23 μg/L，結果見表1。

表1 不同形態Hg、As線性回歸方程及定量限

2.6 精密度試驗

分別取1 ng/mL Hg和5 ng/mL As不同形態混合標準品溶液，在設定的HPLC-ICP-MS條件下，連續進樣6次，以Hg、As各形態峰面積值計算RSD值。結果表明，Hg、As各形態峰面積的RSD分別為1.92%、2.15%，均小于3%，結果表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取佐塔樣品（批號ZT0901），分別按“2.4”項方法制備供試品溶液，并于制備后0、2、4、8、12 h測定Hg（人工胃液）和As不同形態含量。結果表明，不同時間點Hg2+、AsIII、AsV質量分數RSD分別為1.07%、2.23%、1.97%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取佐塔樣品（批號ZT0901）6份，分別按“2.4”項方法制備供試品溶液，按上述色譜和質譜條件分別測定Hg（人工胃液）和As不同形態含量。結果表明Hg2+、AsIII、AsV質量分數均值分別為147.65、10.55、42.30 μg/g，RSD分別為3.18%、4.07%、4.33%，均小于5%，說明重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取重復性實驗佐塔樣品（批號ZT0901）適量，分別取30 mg和50 mg，各6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入5.00 μg/mL的Hg元素標準溶液、0.50 μg/mL的 AsIII標準溶液和2.00 μg/mL的AsV標準溶液各1 mL，按“2.4”項方法制備供試品溶液，按上述色譜和質譜條件分別測定Hg和As不同形態含量，計算加樣回收率。結果表明，Hg2+加樣回收率在88.26%～95.74%，RSD為3.13%；AsIII加樣回收率在82.68%～98.59%，RSD為6.36%；AsV加樣回收率在82.27%～93.75%，RSD為5.04%。

2.10 汞、砷形態及價態分析

取佐塔粉末適量，精密稱定，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜和質譜條件分別測定Hg和As不同形態及價態含量。結果表明，9批佐塔樣品在以人工腸液為溶媒時，Hg2+質量分數為0.19～8.75 μg/g，以人工胃液為提取溶媒時，Hg2+質量分數為10.77～724.86 μg/g，總量在11.25～725.13 μg/g，均未檢出MeHg和EtHg；9批佐塔樣品在以人工腸液為提取溶媒時，AsIII和AsV質量分數分別在6.68～67.53 μg/g和36.06～289.03 μg/g，總量在52.85～317.13 μg/g，均未檢出AsC、AsB、DMA、MMA，不同形態Hg測定結果見表2，As測定結果見表3。

2.11 佐塔安全性評價

佐塔在藏醫臨床使用過程中常與諸藥相配，起到增強療效，降低毒性的作用。對藏醫臨床以佐塔為輔劑的藏藥制劑的調研發現，不同制劑中佐塔加入量不盡相同，根據其用法用量可得出不同藏藥制劑中佐塔日服量在0.007～0.192 g，結果見表4。根據9批佐塔樣品在以人工胃腸液為溶媒提取可溶性Hg和As總量（表2、3），并按佐塔最大日服劑量0.2 g推算機體通過胃腸攝入可溶性Hg和As的量分別在0.002～0.145 mg和0.011～0.063 mg，均值分別為0.057 mg和0.027 mg（表5）。與世界糧食及農業組織和世界衛生組織建議的Hg和As的每日允許攝入量（allowable daily intake，ADI）值0.043 mg和0.12～0.13 mg相比，9批佐塔樣品可溶性As含量低于ADI值；可溶性Hg除ZT0903、ZT0905、ZT0907、ZT0908等批次外，其余均低于ADI值，說明不同藏醫院生產佐塔質量差異較大。

3 討論

本實驗模擬人體胃腸環境研究佐塔中Hg、As形態及價態，以期為其臨床用藥安全性提供數據支撐。供試品溶液的制備方法參照《中國藥典》2020年版四部通則2322汞、砷元素形態及價態測定法[13]進行，并在此基礎上對供試品溶液的制備方法進行優化，考察了超聲提取和震蕩提取2種方法，對提取時間、靜置時間進行篩選，結果表明以37 ℃水浴中超聲處理2 h，靜置24 h效果最佳。

表2 佐塔中不同形態Hg含量測定結果(n = 3)

“?”未檢出，下表同

“?” not detected, same as below

表3 佐塔中不同形態As含量測定結果(n = 3)

表4 含佐塔藏藥制劑規格及用法用量情況

9批佐塔中As元素均以AsIII和AsV形式存在，總量在52.85～317.13 μg/g，按佐塔最大日服劑量0.2 g推算機體攝入可溶性As的量為0.011～0.063 mg，低于FAO和WHO建議的As元素ADI值；Hg元素以毒性較小的無機汞（Hg2+）形式存在，未檢出毒性較大的有機汞（MeHg和EtHg），雖部分批次可溶性Hg量略超ADI值，但結合課題組前期研究結果及佐塔毒理研究的有關報道[14-16]，佐塔僅在超劑量或長期用藥（30 d以上）時，Hg才在動物主要臟器內蓄積，但均未表現出明顯的不良反應。在藏醫臨床，佐塔一般以佐劑的形式在復方中于治療中風、麻痹病、高血壓、神經系統[17]等疾病，其臨床用藥周期最長為1個月[18]。因此，在藏醫臨床指導下規范使用佐塔，具有較高的安全性。

表5 含佐塔制劑每日Hg、As最大攝入量

不同批次佐塔樣品在人工胃液中Hg2+含量（10.77～724.86 μg/g）遠高于人工腸液含量（0.19～8.75 μg/g），這主要與佐塔主要成分為HgS有關。在酸性條件下，HgS可部分被轉化為可溶性Hg2+，而在堿性條件下，HgS較為穩定，從而導致人工胃液中Hg2+的含量遠高于人工腸液。佐塔是以劇毒水銀為原料，炮制過程中需經復雜的水銀洗煉法祛污祛毒后才能達到降低毒性的作用，其中濕法洗煉是用童子尿等液體輔料反復洗煉水銀，以除去其中可溶性Hg鹽，如Hg(SCN)2、Hg(NO3)2等[19]。由于不同藏醫院水銀洗煉工序所有輔料、洗煉順序和次數等不盡相同，使可溶性Hg鹽祛除程度不一，從而導致不同藏醫院炮制佐塔可溶性Hg2+差異較大。因此，在佐塔炮制工藝高度保密的情況下，通過測定其人工胃腸液中Hg2+含量，可作為評價佐塔炮制工藝的是否規范合理的標準之一。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Safety evaluation, elemental speciation and valence state analysis of mercury and arsenic of Tibetan medicine Zuota based on HPLC-ICP-MS

HAILAI Yue-bu1, 2, 3, QUN Pei1, 4, LU Jun-rong5, JIANG Min-tao5, WEN Yang1, 2, 3, MA Quan1, 2, 3, GAI Rong-yin6, LI Wen-bing2, 3, LIU Yuan2, 3, 7

1.College of Pharmmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610225, China 2.Sichuan Qiang-Yi Medicinal Resources Protection and Utilization Technology Engineering Laboratory, Chengdu 610225, China 3.Key Laboratory of Tibetan Plateau Ethnic Medicinal Resources Protection and Utilization of National Ethnic Affairs Commission, Chengdu 610225, China 4.Tibet Ganlu Tibetan Medicine Co., Ltd., Lasa 850000, China 5.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 6.Chengdu Shimadzu Instrument Equipment Co., Ltd., Chengdu 611900, China 7.Ethnic Medicine Institute, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China

To analyze the elemental speciation and valence state of mercury and arsenic in the Tibetan medicine Zuota, and evaluate its safety combining with its preparation’s usage and dosage, so as to provide theoretical basis for its clinical application.The HPLC-ICP-MS method was used to detect the elemental speciation and valence state of mercury and arsenic in Zuota in artificial gastric and intestinal juice.The intake of soluble mercury and arsenic was calculated according to the usage and dosage of Zuota in its preparation.By detecting nine batches of Zuota, the result showed that the elemental speciation of mercury existed in artificial gastric and intestinal juice was inorganic mercury.The valence state of mercury was divalent mercury (Hg2+), and the content of it was 11.25—725.13 μg/g.The elemental speciation of arsenic existed in artificial gastric and intestinal juice was organic arsenic.The valence state of arsenic were trivalent arsenic (AsIII) and pentavalent arsenic (AsV), and the content of them were 6.68—67.53 μg/g and 36.06—289.03 μg/g respectively.What’s more, methylmercury (MeHg), ethylmercury (EtHg), arsenic choline (AsC), arsenic betaine (AsB), monomethyl arsenic (MMA), and dimethyl arsenic (DMA) were not detected in it.The maximum daily dose of Zuota in its preparation is 0.2 g.So the intake of soluble mercury and arsenic would be calculated as 2.3—145.0 μg and 10.6—63.4 μg respectively every day.Thus, the use of Zuota in clinic would be with highly safety.

Tibetan medicine; Zuota; mercury; arsenic; elemental speciation; valence state; intake; safety evaluation

R283.6

A

0253 - 2670(2022)10 - 2985 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.007

2021-10-29

國家重點研發計劃項目（2018YFC1708005）；四川省藥品監督管理局項目（510201201810173）；中央高校基本科研業務費專項資金研究類項目（2021PTJS35）

海來約布（1994—），男，彝族，碩士研究生，研究方向為民族藥品種、質量與資源開發。E-mail: 1157820560@qq.com

通信作者：李文兵（1988—），男，博士，副研究員，研究方向為民族藥炮制工藝及質量標準研究。Tel: 13540876731 E-mail:285892232@qq.com

劉 圓（1968—），女，博士生導師，教授，從事少數民族藥物研究和教學。Tel: (028)85528812 E-mail: 499769896@qq.com

#共同第一作者：群 培（1993—），男，藏族，碩士研究生，研究方向為民族藥品種、質量與資源開發。E-mail: 1679231848@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]