LncRNA ZFAS1靶向miR-373導致肝癌細胞順鉑耐藥的機制研究

余奎楊，劉攀，張浩文，秦濤，胡明星

大多數肝癌患者確診時已至中晚期，部分患者通過手術切除、系統治療與局部治療結合等方法減小腫瘤體積，降低腫瘤分期，但術后復發率較高，多數患者術后生存不理想。藥物治療特別是抗血管生成藥物聯合免疫治療可在一定程度上提高生存率，但由于輻射抗性和耐藥性影響了治療效果［1］。探索癌癥耐藥過程中的分子機制，篩選新的干預靶點對于癌癥治療十分重要。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是近年來的研究熱點。有研究發現LncRNA鋅指結構反義轉錄本1（zine finger antisense 1，ZFAS1）在大腦、心臟、腎臟、胰腺、胸腺中穩定表達［2］，并且在宮頸癌中高表達，沉默ZFAS1會抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并降低順鉑（cisplatin，DDP）的耐藥性［3］。ZFAS 1在肝癌中亦高表達，可能促進癌細胞轉移并導致預后不良［4］，但ZFAS1與肝癌耐藥性關系的相關研究尚鮮見。ZFAS1能夠調控微小RNA（microRNA，miRNA）的表達，從而影響miRNA功能。肝癌細胞中miR-373表達下調，促進乙型肝炎病毒的復制［5］。miR-373在胰腺癌中呈低表達，上調miR-373可通過抑制細胞增殖、侵襲，從而提高化療敏感性［6］。目前LncRNAZFAS1、miR-373與肝癌細胞順鉑耐藥關系的研究尚罕見。順鉑本身化學性質并不活躍，進入細胞后，會與細胞內親核分子作用形成加合物，其中細胞核或線粒體內DNA為順鉑的主要作用位點，順鉑能破壞DNA的結構和功能，導致DNA斷裂或編碼錯誤，無法轉錄，延緩癌細胞周期。本研究旨在探究ZFAS1對肝癌細胞系HepG2順鉑耐藥的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系HepG2（中國科學院細胞庫，目錄號：SCSP-510）；順鉑（美國Harvey公司，貨號：C21384；純度：99.0%）；si-NC序列、si-ZFAS1序列、inhibitor NC、inhibitormiR-373、mimic NC、mimicmiR-373、ZFAS1WT、ZFAS 1MUT、LipofectamineTM3000均購自廣州銳博生物科技有限公司，cDNA合成試劑盒、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（碧云天生物技術，產品編號分別為D7170S、C0038）；2×SYBR qPCR Mix（北京百奧萊博科技有限公司，CAS：PC3301）；兔 源 一 抗 基 質 金 屬 蛋 白 酶（MMP）2、MMP9、GAPDH，羊抗兔二抗，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（英國Abcam公 司，貨 號 分 別 為ab92536、ab76003、ab9485、ab205718、ab228530）。Transwell小室（北京優尼康生物科技有限公司，型號：3413）；實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）儀（美國ABI公司，型號：ABI Veriti）；增強型化學發光檢測系統（上海Tanon公司，型號：4100）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 實驗分組1：正常培養組、si-NC組（轉染si-NC陰性序列）、si-ZFAS1組（轉染si-ZFAS1序列）。實驗分組2：si-NC組和si-ZFAS1組分別添加0、50、100、200、300μmol/L順鉑處理細胞12 h。實驗分組3：si-NC組（轉染si-NC陰性序列）、si-ZFAS1組（轉染si-ZFAS1序列）、si-ZFAS1+inhibitor NC組（轉染si-ZFAS1序列+inhibitor NC）、si-ZFAS1+inhibitormiR-373組（轉染si-ZFAS 1序列+inhibitormiR-373）。取對數生長期細胞，每組1×106個/mL，按照說明書使用LipofectamineTM3000對應轉染6 h，更換為完全培養液培養48 h進行實驗。

1.2.2 qRCR檢測實驗分組1細胞中ZFAS 1、miR-373的表達 6孔板培養細胞并收集，每孔加500μL Trizol，提取總RNA，cDNA合成試劑盒合成cDNA，qPCR檢測細胞中ZFAS1、miR-373的表達。引物序列：ZFAS1上游引物5′-ACGTGCAGACATCTACAACCT-3′、下游引物5′-TACTTCCAACACCCGCAT-3′，產物大小327 bp；GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，產物大小197 bp；miR-373上游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′、下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，產物大小127 bp；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，產物大小89 bp。20μL反應體系：1μL cDNA（50 mg/L）、10μL 2×SYBR qPCR Mix、上下游引物（均為10μmol/L）各0.5μL，8μL ddH2O；反應條件：預變性94℃60 s；變性95℃30 s，退火（ZFAS1：61℃45 s；miR-373：60℃30 s），40個循環。2-ΔΔCt法計算ZFAS1、miR-373相對表達水平。

1.2.3 CCK-8法檢測實驗分組2細胞增殖情況 將細胞以5×104個/孔接種至96孔板中，每孔加100μL完全培養液，待細胞貼壁后，每孔加入10μL CCK-8試劑，37℃5%CO2培養箱內孵育2 h，酶標儀在450 nm波長處測定光密度（OD）值，增殖率=樣品孔OD450/對照OD450×100%。

1.2.4 Transwell檢測實驗分組2細胞侵襲情況 收集細胞并計數板計數，各組細胞稀釋成1×103個/mL，添加無胎牛血清培養液。24孔板中每孔加500μL完全培養液，Transwell小室經基質膠上下包被后放入24孔板中，小室中加入500 mL無胎牛血清細胞稀釋液，37℃5%CO2培養箱中培養48 h，結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數。取上、下、左、右、中5個不同視野，計算視野中細胞之和，記為侵襲細胞數量。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測實驗分組2、3細胞中MMP2、MMP9蛋白表達 收集1×106個細胞，添加蛋白裂解酶冰上裂解細胞10 min，收集至離心管中，12 000 r/min 4℃離心20 min，上清液即為細胞總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，每個樣品蛋白總量20μg置于聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離。凝膠上蛋白轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉NC膜2 h，加入一抗MMP2（1∶2 000）、MMP9（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）4℃孵育過夜，對應羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，蛋白顯色液顯色、增強型化學發光檢測系統檢測蛋白表達情況。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶鑒定miR-373與ZFAS1的靶向位點 Starbase分析miR-373與ZFAS1是否存在互補的結合位點；將miR-373與ZFAS 1結合位點及突變位點的序列克隆重組至pGL3-basic熒光素酶報告載體，構建ZFAS1野生型（ZFAS1WT）及突變型（ZFAS1MUT）熒光素酶報告載體，分別與mimicmiR-373或mimic NC共轉染至HepG2中，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶相對活性。

1.3 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 25.0進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干擾ZFAS1對細胞中ZFAS1、miR-373表達的影響 si-ZFAS1組細胞中ZFAS1表達水平均低于正常培養組和si-NC組（P＜0.05），miR-373表達水平均高于正常培養組和si-NC組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Effects of ZFAS1 interference on the expression of ZFAS1 and miR-373 in cells表1 干擾ZFAS1對細胞中ZFAS1、miR-373表達的影響（n=6，±s）

Tab.1 Effects of ZFAS1 interference on the expression of ZFAS1 and miR-373 in cells表1 干擾ZFAS1對細胞中ZFAS1、miR-373表達的影響（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與正常培養組比較，b與si-NC組比較，P＜0.05。

組別正常培養組si-NC組si-ZFAS1組F ZFAS1 1.02±0.13 0.99±0.09 0.46±0.05ab 64.953＊miR-373 1.01±0.08 0.98±0.09 1.48±0.24ab 19.631＊

2.2 不同濃度順鉑處理及干擾ZFAS1后HepG2細胞增殖情況 si-NC組中，0、50、100、200μmol/L順鉑處理后細胞增殖率依次降低（P＜0.05），300μmol/L順鉑與200μmol/L順鉑差異無統計學意義（P＞0.05）。si-ZFAS1組，0、50、100、200、300μmol/L順鉑處理后細胞增殖率依次降低（P＜0.05）。si-ZFAS1組細胞增殖率分別低于其對應濃度的si-NC組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of cell proliferation after treatment with different concentrations of cisplatin between the two groups表2 2組經不同濃度順鉑干預后細胞增殖情況比較 （n=6，%，±s）

Tab.2 Comparison of cell proliferation after treatment with different concentrations of cisplatin between the two groups表2 2組經不同濃度順鉑干預后細胞增殖情況比較 （n=6，%，±s）

＊P＜0.05；a與0μmol/L比較，b與50μmol/L比較，c與100μmol/L比較，d與200μmol/L比較，P＜0.05。

組別si-NC組si-ZFAS1組t 0μmol/L 100.00±0.00 79.65±8.89 5.607＊50μmol/L 86.16±8.46a 53.52±6.68a 7.417＊100μmol/L 56.89±7.95ab 26.16±4.05ab 8.437＊200μmol/L 21.48±6.49abc 6.27±0.46abc 5.726＊300μmol/L 19.86±4.31abc 0.55±0.02abcd 10.974＊F 204.902＊235.867＊

2.3 不同濃度順鉑處理及干擾ZFAS1后HepG2細胞侵襲情況 2組經不同濃度順鉑處理后細胞侵襲數量差異均有統計學意義；隨順鉑濃度升高，細胞侵襲數量基本呈降低趨勢。si-ZFAS1組細胞侵襲數量分別低于其對應濃度的si-NC組（P＜0.05），見圖1、表3。

2.4 不同濃度順鉑處理及干擾ZFAS1后HepG2細胞中MMP2、MMP9蛋白表達情況 2組經不同濃度順鉑處理后MMP2、MMP9蛋白表達差異均有統計學意義。2組100、200、300μmol/L順鉑處理后MMP2蛋白表達水平均低于0、50μmol/L順鉑，50μmol/L順鉑低于0μmol/L順鉑（P＜0.05）；si-ZFAS1組300μmol/L順鉑處理后低于100μmol/L順鉑（P＜0.05）。2組50、100、200、300μmol/L順鉑處理后MMP9蛋白表達水平均低于0μmol/L順鉑（P＜0.05）；si-NC組300μmol/L順鉑處理后均低于50、100μmol/L順鉑（P＜0.05），si-ZFAS1組100、200、300μmol/L順鉑處理后低于50μmol/L順鉑（P＜0.05）。si-ZFAS 1組MMP2、MMP9蛋白表達水平分別低于其對應濃度的si-NC組（P＜0.05），見表4、5，圖2。

Fig.1 Cell invasion in the two groups(×200)圖1 2組細胞侵襲情況（×200）

Tab.3 Comparison of the number of invasive cells after treatment with different concentrations of cisplatin between the two groups表3 2組經不同濃度順鉑干預后細胞侵襲數量比較 （n=6，個/視野，±s）

Tab.3 Comparison of the number of invasive cells after treatment with different concentrations of cisplatin between the two groups表3 2組經不同濃度順鉑干預后細胞侵襲數量比較 （n=6，個/視野，±s）

＊P＜0.05；a與0μmol/L比較，b與50μmol/L比較，c與100μmol/L比較，d與200μmol/L比較，P＜0.05。

組別si-NC組si-ZFAS1組t 0μmol/L 256.86±8.13 149.16±6.22 25.772＊50μmol/L 157.46±5.15a 76.16±4.18a 30.024＊100μmol/L 106.92±6.16ab 63.15±2.19ab 16.399＊200μmol/L 86.53±4.87abc 46.86±2.82abc 17.267＊300μmol/L 78.49±4.48abc 3.12±0.63abcd 40.808＊F 931.741＊1 226.393＊

Tab.4 Comparison of the relative expression of MMP2 protein between the two groups表4 2組細胞中MMP2蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of the relative expression of MMP2 protein between the two groups表4 2組細胞中MMP2蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05；a與0μmol/L比較，b與50μmol/L比較，c與100μmol/L比較，P＜0.05。

組別si-NC組si-ZFAS1組t 0μmol/L 0.86±0.08 0.43±0.04 11.776＊50μmol/L 0.73±0.06a 0.34±0.05a 12.231＊100μmol/L 0.36±0.04ab 0.12±0.03ab 11.758＊200μmol/L 0.36±0.08ab 0.09±0.01ab 8.203＊300μmol/L 0.33±0.04ab 0.04±0.01abc 17.229＊F 94.393＊168.058＊

Tab.5 Comparison of the relative expression of MMP9 protein between the two groups表5 2組細胞中MMP9蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

Tab.5 Comparison of the relative expression of MMP9 protein between the two groups表5 2組細胞中MMP9蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05；a與0μmol/L比較，b與50μmol/L比較，c與100μmol/L比較，P＜0.05。

組別si-NC組si-ZFAS1組t 0μmol/L 1.21±0.07 0.86±0.05 12.124＊50μmol/L 0.81±0.09a 0.43±0.03a 9.812＊100μmol/L 0.76±0.06a 0.12±0.03ab 23.369＊200μmol/L 0.69±0.08a 0.09±0.01ab 18.229＊300μmol/L 0.58±0.09abc 0.08±0.01ab 13.525＊F 55.418＊756.867＊

Fig.2 The expression levels of MMP2 and MMP9 in the two groups圖2 2組細胞中MMP2、MMP9蛋白水平情況

2.5miR-373與ZFAS1的靶向位點驗證 Starbase分析miR-373與ZFAS 1存在互補的結合位點，見圖3。與mimic NC+ZFAS1WT（1.02±0.09）相比，mimicmiR-373+ZFAS1WT（0.46±0.05）熒光素酶相對活性下 降（t=13.323，n=6，P＜0.05）；mimic NC+ZFAS 1MUT（0.98±0.08）與mimicmiR-373+ZFAS1MUT（1.01±0.12）熒光素酶相對活性差異無統計學意義（t=0.510，n=6，P＞0.05）。

Fig.3 The targeting sites of miR-373 and ZFAS1圖3 miR-373與ZFAS1的靶向位點

2.6miR-373對細胞中MMP2、MMP9蛋白表達的影響 si-ZFAS1組、si-ZFAS1+inhibitor NC組細胞MMP2、MMP9蛋白表達水平低于si-NC組（P＜0.05）；si-ZFAS1+inhibitormiR-373組細胞MMP2、MMP9蛋白表達水平高于si-ZFAS 1組和si-ZFAS 1+inhibitor NC組（P＜0.05），見圖4、表6。

Fig.4 Effects of miR-373 on the protein levels of MMP2 and MMP9 in cells圖4 miR-373對細胞中MMP2、MMP9蛋白水平的影響

3 討論

順鉑可與DNA結合形成DNA復合物，激活DNA損傷反應，最終達到殺死腫瘤細胞的目的［7］；但隨其劑量增加，順鉑的效果受到限制，導致腫瘤復發和轉移，出現耐藥現象，這也是肝癌患者預后不良的常見原因［8］。因此，尋找降低順鉑耐藥性的方法對于提高肝癌治療效果具有較高價值。

Tab.6 Comparison of relative expression levels of MMP2 and MMP9 protein between the four groups表6 4組細胞中MMP2、MMP9蛋白相對表達量比較（n=6，±s）

Tab.6 Comparison of relative expression levels of MMP2 and MMP9 protein between the four groups表6 4組細胞中MMP2、MMP9蛋白相對表達量比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與si-NC組比較，b與si-ZFAS1組比較，c與si-ZFAS1+inhibitor NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC組si-ZFAS1組si-ZFAS1+inhibitor NC組si-ZFAS1+inhibitor miR-373組F MMP2蛋白0.56±0.08 0.13±0.02a 0.14±0.01a 0.46±0.05abc 123.979＊MMP9蛋白0.36±0.03 0.08±0.01a 0.06±0.01a 0.28±0.02bc 351.467＊

本研究旨在探究ZFAS1在肝癌耐藥性中的作用。ZFAS 1作為新發現的LncRNA，是Zinc finger NFX1型基因的反義RNA，被鑒定為乳腺上皮細胞分化的調節因子［9］。之后有研究發現ZFAS1作為促癌基因在神經膠質瘤、肺癌、結腸癌、肝癌、卵巢癌和胃癌等多種惡性腫瘤中表達上調［10］；ZFAS1與肝癌時肝內、外侵襲及預后不良等臨床病理特征關系密切，其可能作為預測患者預后的一種新的生物標志物［11］。更深入的研究顯示，ZFAS1不僅影響預后，也與卵巢癌治療過程中順鉑耐藥性及化療敏感性有關［12］，但在肝癌中尚未發現其與順鉑耐藥性之間的關系。本研究結果顯示，0～200μmol/L順鉑處理肝癌細胞后，細胞增殖率隨順鉑濃度的增高而降低，但當順鉑濃度為300μmol/L時，細胞增殖率則無明顯變化，提示當順鉑達一定濃度時，肝癌細胞可能會產生耐藥性，導致順鉑的效果受到抑制。同時，以不同濃度順鉑處理肝癌細胞后檢測細胞侵襲情況和侵襲蛋白MMP2、MMP9表達情況，結果亦顯示，順鉑在一定程度上能夠抑制細胞侵襲，但達一定濃度時該作用減弱。另外，同一濃度順鉑處理肝癌細胞，干擾ZFAS1后，細胞增殖率、侵襲細胞數量及侵襲蛋白MMP2、MMP9表達水平均較si-NC組明顯降低，提示在肝癌細胞中抑制ZFAS1的表達能夠提高化療敏感性。

進一步研究發現，ZFAS1通過調控miRNA實現對順鉑耐藥性的逆轉。在膠質瘤中下調ZFAS1表達可促進miR-432-5p過表達進而抑制細胞活力，從而降低神經膠質瘤細胞對順鉑的耐藥性［13］。miR-373、miR-423-5p、miR-370-3p在三陰性乳腺癌中可影響順鉑耐藥性［14］。miR-373作為其中一員，與腫瘤增殖、凋亡、侵襲、遷移等關系密切，且能影響順鉑耐藥性。miR-373在大腸癌中表達下調，上調miR-373表達可誘導結腸癌細胞凋亡和周期停滯以及抑制細胞生長、遷移和侵襲，并降低5-氟尿嘧啶的耐藥性［15］。LncRNA作為miR-373上游調控因子，是引起miR-373異常表達的重要調控點［16］。但關于肝癌中ZFAS1與miR-373的相關研究尚鮮見。本研究結果顯示，ZFAS1上存在miR-373結合位點，單純干擾ZFAS1能夠促進miR-373的表達；在干擾ZFAS1基礎上添加miR-373抑制劑可升高侵襲蛋白MMP2、MMP9的表達水平，提示在肝癌細胞中干擾ZFAS1可通過上調miR-373的表達抑制蛋白侵襲，進而降低順鉑耐藥性。

綜上所述，干擾ZFAS1可促進miR-373表達來緩解肝癌細胞順鉑耐藥，且此作用可能是通過抑制細胞侵襲實現的。本研究驗證了肝癌細胞中ZFAS1與細胞耐藥之間的關系，但miR-373與侵襲之間的關系尚需進一步驗證。