APC-EPCR-PAR1通路在類風濕關節炎中的研究進展

劉軒綺，劉匯洋，趙京洋，尹芳蕊，3，白力，3，王永福，3△

類風濕關節炎（RA）是一種慢性的、系統性的自身免疫性疾病，通常伴隨著關節的腫脹和畸形，其特征是存在多種自身抗體以及產生大量的細胞因子介導炎癥反應。在醫學的傳統觀念中，RA被認為是一種無法治愈的終生疾病，RA患者須終生進行免疫調節才能有效控制疾病的炎癥反應。目前緩解RA疼痛的藥物主要為非甾體類抗炎藥和糖皮質激素。臨床上廣泛采用甲氨蝶呤、來氟米特等傳統抗風濕藥物來治療RA。傳統抗風濕藥對RA的控制效果有限，最新的治療思路已從大分子生物制劑發展到JAK通路小分子抑制劑的靶向治療。研究證實，活化蛋白C（APC）、內皮蛋白C受體（EPCR）以及蛋白激酶受體1（PAR1）組成的APC-EPCR-PAR1細胞信號通路活化可以發揮細胞保護的作用，達到抗炎的效果［1］。本文就APC-EPCR-PAR1通路在RA中的作用進行綜述，為RA的治療提供新的方向。

1 APC-EPCR-PAR1通路

1.1 通路介紹

1.1.1 EPCR EPCR是一種分子質量為46 ku的Ⅰ型穿膜蛋白受體［2］，主要表達于血管內皮細胞，也可見于樹突狀細胞、白細胞、上皮細胞、心肌細胞、軟骨細胞和成骨細胞。EPCR位于靠近血栓調節蛋白的細胞膜的脂筏隔室上，EPCR在細胞信號轉導中的主要作用是促進其蛋白酶配體激活蛋白酶激活受體（PAR），特別是通過將蛋白酶錨定在PAR附近來激活PAR1，而EPCR的結構與主要組織相容性復合體同源，這也是EPCR能對炎癥起作用的原因。此外，EPCR也可以被基質金屬蛋白酶（MMPs）從細胞表面分離出來，以可溶性EPCR（sEPCR）的形式存在于循環血液中，發揮一定的生物學作用。

1.1.2 PAR PAR是一種G蛋白偶聯受體，由PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4組成［3］，同樣位于細胞膜的脂筏隔室。PAR-1由7個跨膜的α-螺旋、1個G蛋白偶聯的胞質細胞域和1個胞外段的N末端組成。PAR-1表達于除紅細胞外的其他類型細胞［4］。多項研究表明，凝血酶原復合物以及凝血因子Ⅹa（FⅩa）均可激活PAR-2，凝血酶可以激活血管細胞上的PAR-1和PAR-4，以及血小板上的PAR-3-PAR-4復合體。此外，激活的APC、凝血因子Ⅹa、纖溶酶顆粒酶A、胰蛋白酶、MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、MMP-14均可激活PAR-1［5］。

1.1.3 APC-EPCR-PAR1通路概況 APC是由其前體蛋白C（PC）轉化而來的一種天然抗凝血劑，在凝血調控中起著關鍵的作用。當凝血酶與血栓調節蛋白結合時，會啟動機體內抗凝血途徑，將PC激活為APC。當抗凝血酶原與EPCR結合時，凝血酶-血栓調節蛋白復合體會使PC轉變為APC的速度加快。研究表明，APC不僅具有抗凝血作用，還具有抗炎、抗凋亡和維持血管內皮屏障穩定等特性［6］。APC的N段羧基谷氨酸結構域可與EPCR結合，激活內皮細胞上的PAR-1，從而啟動細胞的保護和抗炎反應。研究發現凝血酶激活PAR-1后可在體外誘導促炎細胞因子和趨化因子的表達，引起細胞的促炎反應［7］。但是，當內皮細胞上的EPCR被PC或APC占據時，凝血酶激活PAR-1卻會引起保護性細胞反應的啟動和相應的促炎分子的下調［1］。

未結合的EPCR與小窩蛋白1（CAV-1）在內皮細胞中存在關聯，當EPCR被APC的Gla結構域占據時，EPCR會與CAV-1解離進而激活PAR-1，PAR-1通過β-arrestin-2啟動信號轉導，發揮細胞保護作用（圖1）［8］。

1.2 APC-EPCR-PAR1的作用機制 炎癥增強的主要機制之一是通過胞漿中核因子κB（NF-κB）的激活和核移位來介導，從而啟動各種炎癥介質的生成。有研究認為APC-EPCR-PAR1通路發揮細胞保護作用的機制如下：APC可以減少NF-κB的合成，降低NF-κB的核轉移率，以減少炎性細胞募集并保護微血管，發揮內皮屏障保護的功能［9］。APC與EPCR結合后，EPCR與胞內CAV-1分離，導致EPCR遷出脂筏，與PAR-1相互作用，進一步促進了APC的細胞保護信號的傳遞，發揮相應的功能［10］。

Fig.1 Schematic diagram of the effect of APC combined with EPCR and PAR-1圖1 APC結合EPCR與PAR-1作用示意圖

2 APC-EPCR-PAR1通路

2.1 APC-EPCR-PAR1通路與RA的關系 APC已被證實在多種炎性疾病（炎性腸病、哮喘等）和自身免疫性疾病中發揮細胞保護的作用，從而抑制疾病進展。Xue等［11］發現APC可以預防小鼠膠原性關節炎（CIA）和抗原誘導性關節炎的發生和進展。Bai等［12］發現RA患者中存在膜型EPCR和sEPCR的異常表達，隨后通過構建CIA小鼠模型，證實sEPCR可以有效減輕CIA小鼠滑膜組織的炎癥浸潤和軟骨損傷的程度，緩解CIA小鼠疾病進展。

早前有研究發現炎癥與凝血酶介導PAR-1途徑活化產生的細胞因子和趨化因子有關［13］。目前研究發現PAR家族與自身免疫性疾病的發病也存在關聯性［14-15］。PAR1與實驗性自身免疫性神經炎［14］動物模型和實驗性自身免疫性腦脊髓炎［15］動物模型的發病有關。PAR1會引起內皮細胞的促炎反應，其被凝血酶激活后可增強細胞的通透性，從而加重RA炎癥。有研究表明，APC與EPCR結合后會激活內皮細胞上的PAR-1，將凝血酶依賴的PAR-1信號的特異性從通透性增強轉變為內皮細胞的屏障保護作用，發揮細胞保護和抗炎反應的作用［13］。通過干預APC-EPCR-PAR1通路上的靶點，可以緩解RA的臨床癥狀［16］，且APC-EPCR-PAR1依賴性途徑可以促進骨細胞的增殖，這些結果意味著APC-EPCRPAR1途徑的活化能夠改善關節炎的臨床癥狀。

2.2 APC-EPCR-PAR1通路與免疫細胞的關系

2.2.1 T細胞 RA患者滑膜組織和滑液的T細胞可占滑膜中細胞的30%～50%，且絕大多數是CD4+T細胞［17］。T細胞在RA的發生和進展中發揮著關鍵作用［18］。CD4+T細胞可作為RA發病機制的中心環節，通過與體內巨噬細胞、滑膜成纖維細胞和B細胞等多種效應細胞相互作用，促進炎性介質和MMP的釋放，進而在RA的滑膜炎癥、滑膜增生、血管翳形成、軟骨損傷和骨質破壞等多個環節發揮致病作用［19］。

APC-EPCR-PAR1通路中的EPCR被證實是致病性Th17的負向調節因子，可以有效地抑制促炎性Th17細胞的作用［20］。體內實驗也證實sEPCR可通過抑制Th17分化從而起到緩解CIA小鼠疾病的作用［12］。上述的研究結果提示APC-EPCR-PAR1通路可能通過T細胞對RA起到調控的作用。

2.2.2 單核/巨噬細胞 單核細胞也是RA發病機制中的關鍵效應分子，是RA局部炎癥的重要參與者。且有研究表明單核細胞在RA患者滑膜中產生高濃度的促炎因子腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、白細胞介素6等，且能分化為炎性巨噬細胞，促進局部滑膜炎癥［21］。

研究發現APC可以抑制單核細胞的激活和遷移，并且可以抑制巨噬細胞的促炎反應［22］。Xue等［23］證明RA時EPCR與單核/巨噬細胞的PC/APC共定位，且APC可以通過EPCR抑制RA單核細胞的遷移和活性，對RA疾病活動起到緩解的作用。

2.2.3 樹突狀細胞 樹突狀細胞是專職的抗原提呈細胞，可以通過MHC-Ⅱ將外源性和內源性抗原呈遞給記憶T細胞。樹突狀細胞還可以遷移至中樞淋巴器官和滑膜生發中心，呈遞抗原，激活T細胞，進而激活B細胞，被激活的滑膜B細胞產生自身抗體，從而促進滑膜炎癥［24］。EPCR同樣也在樹突狀細胞上表達，而且研究也證實了在樹突狀細胞上可以檢測到EPCR和PAR-1，且APC介導樹突狀細胞減緩炎癥作用的過程依賴于EPCR［25］。

2.2.4 中性粒細胞 目前對于RA疾病中的發病機制的研究主要集中于T細胞和其他各類適應性免疫細胞［26］。中性粒細胞胞外捕獲網（Nets）的形成過程與RA疾病的進展有相關性［27］。Nets由中性粒細胞細胞外DNA纖維、組蛋白、彈性蛋白酶和髓過氧化物酶組成［28］。Nets能幫助中性粒細胞固定并誘捕細菌、真菌或病毒，從而更有效地消除這些病原體［29］。也有研究表明，Nets過度形成會附著于血管內皮，進而使內皮細胞凋亡，導致組織損傷［30］。此外，Nets會釋放內源性危險信號，如自身抗原到血液中，進而介導RA患者產生相應的自身抗體，如抗環瓜氨酸肽抗體，誘發自身免疫反應并參與RA進展［31］。Nets形成還會導致炎性因子釋放增加，而炎性因子的聚集又可以進一步促進Nets，并抑制中性粒細胞凋亡，形成惡性循環，加重RA疾病進展。

APC可以抑制體外Nets的形成和體內Nets的激活［32］。EPCR在眾多白細胞中表達。APC依賴EPCR途徑可以抑制中性粒細胞的趨化能力［33］。EPCR是RA的負向調控因子，中性粒細胞Nets又參與了RA的發病。

2.3 APC-EPCR-PAR1通路與非免疫細胞的關系

2.3.1 破骨細胞 破骨細胞過度活化是導致RA骨侵蝕發生的重要原因。破骨細胞由單核細胞分化而來，同時Th17細胞也可以促進它的分化。研究發現APC主要通過EPCR-PAR1途徑抑制人破骨細胞的分化，并且該途徑可以促進骨合成的代謝［34］。

2.3.2 成纖維樣滑膜細胞 成纖維樣滑膜細胞可以被Th17細胞刺激，誘導核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的產生，促進破骨細胞的形成，介導RA的進展［35］。APC-EPCR-PAR1通路可以抑制人破骨細胞的分化，且sEPCR可以通過抑制Th17的分化緩解CIA小鼠病情［12］。因此可以推測，EPCR緩解RA疾病以及APC-EPCR-PAR1對破骨細胞的抑制作用可能是通過成纖維樣滑膜細胞實現的。

3 藥物開發

APC可以抑制體內白細胞的促炎反應，起到抗炎和細胞保護的作用。同時APC在RA的調控中也起著重要的作用。APC對關節炎治療起正向調控作用，而且已被證實可以通過APC-EPCR-PAR1通路抑制破骨細胞的分化，從而有效減緩骨破壞程度［34］。此外，有證據表明EPCR可以促進APC的活化過程，在體內實驗中證實，在對EPCR敲除的CIA小鼠進行APC干預后，APC的治療效果顯著降低［11］。這就意味著APC-EPCR-PAP1通路可能是治療RA的藥物研究的重要靶點。

目前對于APC-EPCR-PAR1通路開發的藥物研究較少，不過已有研究針對該靶點研發出APC突變體3K3A-APC。在腦卒中患者中，3K3A-APC依賴于APC-EPCR-PAR1細胞信號通路，發揮神經保護的作用，從而緩解疾病的進展［36］。今后可對該通路上其他靶點對RA的影響展開研究，為RA患者提供更好的治療方案。