5-氮雜-2′-脫氧胞苷對人甲狀腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其機制的研究

程冉，魏楓，張苑，劉美嵐，賀佳

甲狀腺癌是內分泌系統中最為常見的惡性腫瘤，75%的患者為女性［1］，但近些年發病率和病死率的性別差異正在逐漸縮小［2］。多項研究證明，表觀遺傳變化在甲狀腺癌的發生發展中起著關鍵作用，表觀遺傳變化并不涉及DNA的序列變化，更易受到年齡、環境、生活方式和飲食習慣的影響［3-5］。在表觀遺傳中，DNA甲基化是變化方式之一，主要依賴于DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs），DNMTs包含多種亞型，共同參與維持DNA復制中的甲基化［6］。死亡相關蛋白激酶（deathassociated protein kinase，DAPK）是一種由鈣調蛋白調節的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在不同種類的細胞凋亡系統中均有表達，負責啟動細胞的凋亡程序，誘導細胞程序性死亡，是凋亡的正性調節因子。在甲狀腺癌中，DAPK基因以高度甲基化的形式存在［7］。5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）是一種DNMT抑制劑，在DNA復制過程中，其一方面直接與DNA單鏈結合，另一方面可催化蛋白酶體依賴的DNMT1的降解，發揮去甲基化的生物活性［8］。目前，5-Aza-CdR已廣泛應用于血液腫瘤的治療［9］，但其在甲狀腺癌中的應用尚少，作用機制尚不清楚。本實驗通過建立人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞裸鼠移植瘤模型，在動物水平觀察5-Aza-CdR的抑瘤作用及對DAPK與DNMTs的影響，了解其體內抗癌效果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料（1）細胞與實驗動物。TPC-1細胞株購自上海分子與細胞生物學研究中心。4周齡BALB/c雌性裸鼠16只，體質量（14.6±0.4）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。（2）主要試劑。DMEM培養基購自Corning公司；5-Aza-CdR購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）購自Invitrogen公司；青-鏈霉素（100×）購自Gibco公司；TIANamp Genomic DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；EZ-96 DNA Methylation-LightningTMKit購自ZYMO RESEARCH公司；兔抗人DAPK抗體購自美國CST公司；鼠抗人單克隆抗體DNMT1、DNMT3A、DNMT3B，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔/鼠預吸附IgG H&L二抗購自英國Abcam公司；βtubulin抗體購自Gene Tex公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建立人甲狀腺癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型 于培養瓶中培養TPC-1細胞，待細胞覆蓋培養瓶壁80%～90%后傳代，收集對數生長期的細胞進行實驗。TPC-1細胞經胰酶消化后，用完全培養基將細胞重懸成細胞懸液，細胞計數后調整密度為1×107/mL。隨后吸取1 mL細胞懸液接種于裸鼠右前肢腋下，200μL/只。接種后，將裸鼠置于裸鼠屏障環境中飼養，17 d左右腋下出現3～5 mm結節，移植瘤模型建立成功。

1.2.2 分組及藥物處理 成瘤后用隨機數字表法將荷瘤裸鼠分為對照組和實驗組，每組8只。實驗組按照1μg/g腹腔注射5-Aza-CdR（200μL），每2 d給藥1次，周期4周，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。給藥前用游標卡尺分別測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），利用公式V=a×b2/2計算出腫瘤體積。藥物干預4周后，頸椎脫臼法處死荷瘤裸鼠，分離移植瘤。計算2組腫瘤的平均質量和實驗組抑瘤率。抑瘤率=（1-實驗組平均瘤質量）/對照組平均瘤質量×100%。每個瘤體取小部分做石蠟包埋，其余瘤體去除周圍結締組織、凝血塊，保存于無RNA酶EP管中，在液氮中速凍后放入-80℃冰箱保存。

1.2.3 HE染色 將實驗組與對照組裸鼠移植瘤組織標本浸泡在4%多聚甲醛固定液中，隨后進行組織脫水、透明、浸蠟、組織包埋、切片，再進行復水、染色、脫水、封閉步驟，最后通過顯微鏡下觀察2組腫瘤組織染色結果，同時進行圖像采集。

1.2.4 甲基化特異性PCR檢測移植瘤組織中DAPK甲基化情況 取腫瘤組織30 mg，根據組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。Nanodrop 2000微量分光光度計檢測總DNA的純度和含量。DAPK甲基化上游引物5′-ACCCTGCATGAGGTCTATGA-3′，下游引物5′-CAGGTCAAAGTGAGCGATCTG-3′；DAPK非甲基化上游引物5′-CACGCACATGAGACCTACAG-3′，下游引物5′-ACCAGGATCTCAGCGTAGAAC-3′。PCR反應條件：預變性94℃5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；最后72℃延伸10 min。隨后瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠自動成像系統觀察電泳條帶并拍照，每組實驗重復3次。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測移植瘤組織中DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的蛋白表達 石蠟包埋的甲狀腺癌裸鼠移植瘤組織切成5μm厚的切片。切片脫蠟后，用檸檬酸鹽-EDTA進行抗原修復，切片在3%H2O2中室溫孵育5 min抑制內源性過氧化物酶活性。抗原修復后，用5%BSA封閉液在室溫下封閉切片15 min。分別加入DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B一抗（均為1∶100稀釋）于4℃過夜。次日加入二抗（1∶1 000），置37℃孵箱30 min；DAB試劑盒顯影，顯微鏡下觀察，蒸餾水終止反應，切片在室溫下蘇木精染色3 min，梯度乙醇脫水后，切片用二甲苯透明，用中性樹脂密封，光學顯微鏡下觀察。所有玻片在同一光源背景強度，同一放大倍數下拍照完成。采用Image J圖像分析系統進行半定量分析，計算積分光密度（integrated optical density，IOD）值。

1.2.6 Western blot法檢測移植瘤組織中DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的蛋白表達水平 -80℃冰箱中取出移植瘤組織，加入RIPA裂解液，在冰上使用玻璃勻漿器勻漿，提取總蛋白，BCA蛋白定量法測蛋白濃度，加入溴酚藍后煮沸。每孔上樣量為20μg蛋白，濃縮膠80 V，20 min，分離膠120 V電泳，待溴酚藍染料電泳至凝膠底部時停止電泳。采用半干法轉膜，20 V，60 min，轉膜后TBST洗膜3次，每次10 min，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入DAPK（1∶1 000）、DNMT1（1∶1 000）、DNMT3A（1∶2 000）、DNMT3B（1∶1 000）和βtubulin（1∶500）一抗4℃孵育過夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL發光液顯色。Image J圖像分析系統分析蛋白條帶灰度值，以β-tubulin為內參，計算目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺癌裸鼠移植瘤的生長情況與實驗組抑瘤率 實驗過程中，2組荷瘤裸鼠的飲食與大小便均正常，精神狀態良好。剝離腫瘤組織后發現，移植瘤呈結節狀，與周圍組織分界明顯，包膜完整，與皮膚及皮下結締組織輕微粘連，表面肉紅色，剖面呈魚肉狀，質地中等，偶見白色豆渣狀壞死組織，見圖1。給藥4周后，與對照組相比，實驗組移植瘤體積減小（圖2），質量（單位：g）減輕（0.41±0.11vs.1.30±0.39，t=5.195，P＜0.01），實驗組抑瘤率為45.38%。

Fig.1 Changes of subcutaneous transplanted tumor bodies in nude mice of the two groups圖1 2組裸鼠皮下移植瘤瘤體變化

Fig.2 The growth curves of transplanted tumor in nude mice of the two groups圖2 2組裸鼠移植瘤生長曲線

2.2 移植瘤HE染色結果 對照組移植瘤內細胞呈彌漫性生長，排列密集紊亂，未見組織結構，癌細胞胞漿較豐富，細胞核相互重疊，異型性明顯，可見典型的病理性核分裂象，符合甲狀腺乳頭狀癌特點。實驗組移植瘤內細胞數量減少，胞漿淡染，細胞核淡染，核仁體積小，核分裂象減少，核漿比例減少，部分出現核固縮、核溶解，細胞崩解，結構消失，見圖3。

Fig.3 Pathological results of transplanted tumor in the two groups(HE staining,×200)圖3 2組移植瘤病理結果（HE染色，×200）

2.3 2組移植瘤組織中DAPK甲基化情況 實驗組移植瘤組織DAPK基因甲基化程度較對照組明顯下降，見圖4。

Fig.4 Comparison of DAPK gene methylation between the two groups圖4 2組移植瘤DAPK基因甲基化結果比較

2.4 免疫組化染色結果 人甲狀腺乳頭狀癌裸鼠移植瘤組織細胞的DAPK蛋白主要在細胞質表達，DNMTs主要在細胞質表達，少數在細胞核中表達，陽性細胞呈棕黃色或棕褐色顆粒，細胞核復染為藍色。實驗組可見大部分細胞DAPK表達陽性，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B陽性細胞少見。與對照組相比，實驗組腫瘤組織DAPK蛋白表達升高，DNMT1、DNMT3A蛋白表達降低，DNMT3B表達差異無統計學意義，見表1、圖5。

Tab.1 Semi-quantitative analysis results of protein expressions of DAPK,DNMT1,DNMT3A and DNMT3B in transplanted tumor tissues of the two groups表1 2組移植瘤組織DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表達的半定量分析結果（n=8，IOD，±s）

Tab.1 Semi-quantitative analysis results of protein expressions of DAPK,DNMT1,DNMT3A and DNMT3B in transplanted tumor tissues of the two groups表1 2組移植瘤組織DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表達的半定量分析結果（n=8，IOD，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組實驗組t DAPK 2 472 654±1 040 509 61 503 117±43 738 815 3.816＊＊DNMT1 9 807 901±5 643 785 2 929 843±502 930 3.433＊＊DNMT3A 5 211 760±1 884 872 23 191±7 827 6.155＊＊DNMT3B 35 286±11 266 36 197±11 715 0.125

Fig.5 Protein expressions of DAPK,DNMT1,DNMT3A and DNMT3B in transplanted tumor tissues in nude mice of the two groups(immunohistochemical staining,×400)圖5 2組裸鼠移植瘤組織中DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表達（免疫組化染色，×400）

2.5 Western blot結果 與對照組比較，實驗組DAPK蛋白表達升高，DNMT1、DNMT3A蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；2組DNMT3B蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6。

Fig.6 Protein expressions of transplanted tumor tissues in the two groups圖6 2組移植瘤組織DAPK及DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表達情況

3 討論

DNA啟動子甲基化通過細胞內DNMTs催化介導，以共價鍵的形式連接胞嘧啶環的5位碳原子和S2腺苷蛋氨酸提供的甲基，最終生成5-甲基胞嘧啶，此反應過程并未涉及改變DNA的序列結構，但可有效抑制相關基因的表達［10］。其中，DNMT1負責維持現有的甲基化，其為催化復制后的半甲基化，傳遞表觀遺傳學信息，維持重新甲基化后的甲基化穩定狀態。而DNMT3A和DNMT3B參與DNA的從頭甲基化，將非甲基化的CpG轉化為甲基化的CpG，建立動態甲基化模式［11］。這兩種酶在成人體內細胞中表達量較少，主要在胚胎發育階段發揮作用，其表達失調會導致異常的甲基化［12］。

目前發現的激酶中，絲氨酸/蘇氨酸激酶（STKs）占大多數，DAPK是STKs家族中的重要成員之一，在人類細胞中調控多種生物學功能。DAPK結構域包括DAPK1、DAPK2、DAPK3以及死亡相關蛋白酶誘導凋亡激酶（DRAK）1和DRAK2。DAPK1是一個160 ku的細胞骨架相關蛋白激酶，由1 430個殘基組成，屬于鈣/鈣調蛋白調控的STKs超家族。已有研究證明，DAPK1具有抑制腫瘤發展、調節細胞凋亡、自噬，抑制細胞轉移等作用［13］。但在甲狀腺乳頭狀癌發病機制中，關于DAPK基因的研究不多。

Rodríguez-Rodero等［14］評估了不同腫瘤抑制基因的甲基化模式，在原發性甲狀腺腫瘤中，腫瘤抑制基因經常受到高甲基化的調控。DNA異常高甲基化與DAPK表達的相關性研究表明，DAPK基因啟動子的甲基化可導致甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤細胞淋巴結轉移，DAPK啟動子甲基化程度越高，DAPK的表達量越低，呈負相關，其中啟動子區域的CpG島甲基化可導致DAPK基因失活［6］。另有研究證實，高甲基化導致的DAPK基因表達沉默與淋巴瘤［15］、乳腺癌［16］、小細胞肺癌［17］等惡性腫瘤的發生發展及患者的預后密切相關。

5-Aza-CdR是一種有效的DNA甲基化抑制劑，通過與DNMT共價結合，可特異性抑制其甲基轉移活性，實現去甲基化功能，重新激活抑制惡性腫瘤的基因的表達。研究發現，5-Aza-CdR可抑制白血病和結腸癌細胞的生長［18-19］。Lemaire等［20］研究發現，在小鼠EMT6乳腺腫瘤模型中，小劑量5-Aza-CdR可有效減少腫瘤細胞的克隆數量，當總劑量達到40 mg/kg時，腫瘤細胞的克隆能力完全喪失，5-Aza-CdR的抗腫瘤活性隨治療劑量和時間的增加而增加。而對血液系統惡性腫瘤和食管癌、肺癌、前列腺癌等實體腫瘤患者的初步臨床試驗顯示，5-Aza-CdR的抗腫瘤活性較好，可有效改善腫瘤患者預后，延長部分晚期腫瘤患者的生存期［21-22］。

本研究發現，對照組移植瘤組織中DAPK由于異常甲基化導致基因沉默，致使DAPK蛋白表達下降，實驗組經5-Aza-CdR處理后DAPK表達明顯升高，DNMT1、DNMT3A蛋白表達下降。與此同時，本研究還觀察到人甲狀腺癌移植瘤的生長在5-Aza-CdR作用下受到明顯抑制，移植瘤體積明顯縮小，腫瘤組織局部出現壞死。上述研究結果提示，5-Aza-CdR可使表達沉默的DAPK基因再表達，恢復其抑癌功能，從而抑制人甲狀腺癌移植瘤細胞生長及誘導細胞凋亡，這可能是甲狀腺乳頭狀癌患者使用DNA甲基化抑制劑進行治療的靶點。

本實驗為去甲基化制劑干預甲基化位點預防和治療甲狀腺乳頭狀癌提供了一定的依據，但有關DAPK與DNMTs基因的轉錄、表達調節、甲基化的具體機制以及甲基化與腫瘤和基因轉錄失活的關系等，還需要進一步的探索研究。