Ⅲ～Ⅴ期非透析治療的慢性腎臟病患者血清VK2、Runx2的表達及其與心血管鈣化的關系

符薇薇，陳潔，巫瓊微，羅江賓，李周揚，龍作鵬

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是超過3個月時間出現腎臟結構或功能異常的疾病，我國成年人CKD患病率約為13.39%，而60歲及以上的老年人群患病率達到了19.25%［1］。隨著老齡化社會的到來，近幾年我國CKD患病率呈上升趨勢。CKD病程長，在疾病進展的過程中易引發較多并發癥，其中礦物質和骨代謝異常（mineral and bone disorder，MBD）常見，是導致CKD患者出現心血管鈣化、骨質疏松等疾病的關鍵因素［2］。研究認為，出現心血管鈣化后，CKD患者發生心血管不良事件的風險將顯著增加，心血管鈣化是影響患者預后的獨立危險因素之一［3］。維生素K2（vitamin K2，VK2）是維生素K的一種主要存在形式。相關研究證實，CKD患者多存在VK2缺乏，VK2水平較高者冠心病發生風險較低［4］。另有研究發現，VK2可有效抑制血管平滑肌細胞鈣化［5］。Runt相關轉錄因子2（runtrelated transcription factor 2，Runx2）是一種轉錄因子，可影響軟骨細胞和成骨細胞分化，既往研究多集中在Runx2與骨科疾病方面［6］。然而，近年研究顯示，Runx2表達上調與主動脈瓣鈣化關系密切［7］，但其與CKD患者心血管鈣化相關的臨床研究少見。本研究分析了Ⅲ～Ⅴ期非透析治療的CKD患者血清VK2、Runx2的表達及其與心血管鈣化的關系，以期為臨床提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年1月—2021年6月于四川大學華西三亞醫院診治的CKD患者149例，參照文獻［8］中的診斷標準確診，男84例，女65例，年齡（56.37±10.64）歲。根據估算腎小球濾過率（estimation of glomerular filtration rate，eGFR）對患者進行臨床分期，其中Ⅲ期［eGFR為30～59 mL/（min·1.73 m2）］58例（Ⅲ期組），Ⅳ期［eGFR為15～29 mL/（min·1.73 m2）］52例（Ⅳ期組），Ⅴ期［eGFR＜15 mL/（min·1.73 m2）］39例（Ⅴ期組）。納入標準：臨床分期為Ⅲ～Ⅴ期，且尚未進行透析治療。排除標準：腎小管酸中毒、自身免疫性腎損傷、急性腎損傷；合并惡性腫瘤、原發性甲狀旁腺功能亢進、血液系統疾??；機體存在嚴重感染；合并有原發性心臟瓣膜疾?。蝗焉锘虿溉槠?。本研究經本院倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 心血管鈣化判定 采用胸腹部CT評估患者的主動脈及冠狀動脈的鈣化情況，若血管CT值≥130 HU則判定為存在血管鈣化。另采用彩色多普勒超聲評估所有患者的心臟瓣膜鈣化情況，若主動脈瓣、二尖瓣、三尖瓣瓣葉或瓣環出現1個或多個＞1 mm的強回聲則判定為存在心臟瓣膜鈣化。存在血管鈣化、心臟瓣膜鈣化中的一種或兩種則可判定為存在心血管鈣化［9］，并根據心血管鈣化情況將患者分為鈣化組42例和無鈣化組107例。

1.2.2 檢測方法 收集所有患者的性別、年齡、基礎疾病、原發疾病等一般資料。采用全自動生化分析儀（貝克曼AU680）檢 測 血 磷、鈣、肌 酐（creatinine，Cr）、胱 抑 素C（Cystatin C，Cys C）的水平。所有患者在入組后次日清晨抽取空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液，將其置于-20℃低溫下保存待測。采用上海博研生化試劑有限公司的酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測血清VK2、Runx2的表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0進行數據分析。正態分布的計量資料采用±s表示，2組間的數據比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。計數資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，多重比較時校正檢驗水準α=0.012 5。二分類Logistic回歸分析CKD患者合并心血管鈣化的危險因素。受試者工作特征（ROC）曲線分析血清磷、VK2、Runx2對CKD患者合并心血管鈣化的評估價值。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同CKD分期患者一般情況及血清VK2、Runx2的表達 各組性別、年齡、高血壓、糖尿病及原發疾病差異無統計學意義（P＞0.05）。Ⅲ期組、Ⅳ期組和Ⅴ期組磷、Cr、Cys C、Runx2水平及心血管鈣化率依次升高，而鈣、VK2水平依次降低（P＜0.05），見表1。

2.2 鈣化組和無鈣化組患者一般情況及血清VK2、Runx2水平比較 2組性別、年齡、高血壓、糖尿病、原發疾病構成、鈣及Cr水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與無鈣化組比較，鈣化組磷、Cys C、Runx2水平升高，VK2水平降低（P＜0.05），見表2。

2.3 CKD合并心血管鈣化的影響因素分析 以磷、Cys C、VK2、Runx2為自變量，以CKD是否合并心血管鈣化（是=1，否=0）為因變量，Logistic回歸分析顯示，較高水平的磷、Runx2是CKD患者發生心血管鈣化的危險因素，而較高水平的VK2是其保護因素（P＜0.05），見表3。

2.4 ROC曲線分析 3個指標的診斷效能相當，磷、VK2診斷特異度較高，而VK2和Runx2診斷敏感度較高，見表4、圖1。

Tab.1 Serum VK2 and Runx2 expression levels in CKD patients with different stages表1 不同CKD分期患者血清VK2、Runx2的表達情況

Tab.2 The relationship between the serum expression of VK2 and Runx2 and cardiovascular calcification in two groups of CKD patients表2 有無鈣化組的血清VK2、Runx2的表達與心血管鈣化的關系

Tab.3 Analysis of risk factors for CKD patients with cardiovascular calcification表3 CKD患者合并心血管鈣化的危險因素分析

Tab.4 The evaluation value of phosphorus,VK2 and Runx2 in CKD patients with cardiovascular calcification表4磷、VK2、Runx2對CKD患者合并心血管鈣化的評估價值

Fig.1 ROC curve of phosphorus,VK2,and Runx2 in the evaluation of CKD patients with cardiovascular calcification圖1 磷、VK2、Runx2評估CKD患者合并心血管鈣化的ROC曲線

3 討論

CKD會導致患者腎臟結構和功能出現異常，由于腎臟具有強大的代償能力，因此在疾病早期機體并不會出現明顯異常，而到中晚期腎功能明顯受損時，機體會出現鈣、磷代謝紊亂，這主要是因為腎臟受損后排磷能力大幅降低，進而導致血磷水平升高，而高磷血癥會抑制腸鈣吸收，導致血鈣水平下降［10］。高水平的磷可促進Wnt/β-catenin信號通路活化，誘發血管平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉換，促進心血管鈣化的發生、發展［11］。目前，心血管疾病已成為導致CKD患者死亡的首要病因，而心血管鈣化作為心血管疾病的重要危險因素在疾病的發生、發展中起到了重要的促進作用［12］。因此，合理防治CKD患者心血管鈣化對改善患者的身心健康具有重要的意義。

VK2是一種脂溶性維生素，由于CKD患者血鉀水平較高，因此較多患者需要減少富含鉀食物的攝入，然而這類食物通常也是人類外源性維生素K的主要來源，這使得患者更易出現VK2缺乏［13］。本研究結果發現，Ⅲ期組、Ⅳ期組、Ⅴ期組的VK2水平逐漸降低，且鈣化組的VK2水平低于無鈣化組，表明CKD患者VK2的表達水平與臨床分期和心血管鈣化情況有關。羧基谷氨酸蛋白（matrix gla protein，MGP）是一種鈣化抑制劑，VK2在MGP翻譯后γ-羧化過程中發揮著輔助的作用，羧化后的MGP可有效抑制鈣晶體的生長，進而降低心血管鈣化發生的風險［14］。除MGP外，生長停滯特異性基因產物6（growth arrest specific gene 6，Gas 6）的γ-羧化也需要VK2的參與，Gas 6也是一種抗鈣化因子，其可通過抑制炎癥反應和抗血管平滑肌細胞凋亡來防止心血管鈣化的發生［5］。另有研究證實，VK2可通過抗氧化應激來抑制血管鈣化的發生，而在補充VK2后則可有效抑制模型小鼠主動脈鈣化的進展［15-16］。Mansour等［17］研究顯示，補充VK2可改善腎移植患者的動脈粥樣硬化的程度。由此分析可知，VK2與CKD患者心血管鈣化關系密切。Runx2在血管平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉換的過程中發揮著重要的調控作用，其可通過增加骨鈣蛋白、堿性磷酸酶等物質表達來誘導血管平滑肌細胞表型分化，而分化后的血管平滑肌細胞又會促進Runx2的表達，進而有效促進心血管鈣化的發生、發展［18］。研究顯示，CKD合并血管鈣化模型大鼠的主動脈中Runx2的表達水平明顯升高，而在降低主動脈中Runx2表達后主動脈鈣化程度減輕［19］。Li等［20］研究發現，C1q腫瘤壞死因子相關蛋白13對心血管鈣化有明顯的抑制作用，而抑制Runx2表達則是其主要的作用機制之一。本研究結果顯示，鈣化組的Runx2水平高于無鈣化組，表明Runx2在存在心血管鈣化的患者血清中呈異常高表達，提示Runx2的表達與CKD患者的心血管鈣化情況關系密切，考慮可能是與Runx2能促進血管平滑肌細胞的成骨樣細胞表型轉換有關。進一步分析發現，磷、Runx2高表達是CKD患者合并心血管鈣化的危險因素，而VK2高表達是CKD患者合并心血管鈣化的保護因素，表明除了血磷水平外，Runx2、VK2也是心血管鈣化的重要影響因素，兩者均有望成為評估CKD患者心血管鈣化情況的生物標志物。本研究ROC曲線分析結果顯示，血清VK2、Runx2和血磷評估CKD患者合并心血管鈣化的風險的效能相當，其中磷、VK2診斷特異度較高，而VK2和Runx2診斷敏感度較高，提示臨床可通過檢測VK2、Runx2的表達水平來評估預測CKD患者合并心血管鈣化的風險。

綜上所述，Ⅲ～Ⅴ期非透析治療的CKD患者血清VK2水平隨著分期的增加而降低，Runx2水平隨著分期的增加而增加，Runx2高表達是CKD患者合并心血管鈣化的危險因素，而VK2高表達是CKD患者合并心血管鈣化的保護因素，且兩者對CKD患者合并心血管鈣化的評估價值較高。