扁塑藤素增強順鉑對條件性重編程原代肺癌細胞敏感性的機制

石藝 鐘燕 劉小虎 柯尊富 陳孝 唐欲博

中山大學附屬第一醫院1藥學部，2病理科（廣州 510000）

肺癌是危害人類健康的重大疾病之一。非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的83%，肺腺癌是非小細胞肺癌最主要的病理類型［1］。由于肺癌發現時常為晚期，對于這部分患者來說，含鉑——尤其是順鉑的聯合化療，是一線推薦的標準治療方案［2］。然而在治療中，順鉑耐藥性會導致聯合化療方案失敗，引起NSCLC 復發和轉移并最終致死［3-5］。

NF-E2相關因子（NF-E2-related factor2，NRF2）是調節正常細胞應答反應來抵御外界不良應激刺激的關鍵轉錄因子。研究表明，沉默NRF2 表達能下調血紅素氧合酶1（Heme Oxygenase-1，HO-1）的表達并增強骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性［6］。

目前，天然化合物提高化療敏感性，克服化療耐藥性的策略已被廣泛研究［7］。扁塑藤素是一種從衛矛科和翅子藤科植物中提取的醌甲基三萜類化合物，在結腸癌，乳腺癌，肺癌等許多癌種中展現了強大的抗癌活性［8-10］，但其潛在機制還不明確。有研究報道，扁塑藤素能夠通過抑制Chk1∕53BP 介導的DNA 損傷修復增敏吉西他濱［11］。

條件性重編程（conditional reprogramming，CR）技術是一種體外培養永生化原代細胞的方法，它無需進行基因操作，簡單快速，成功率高，避免了多次傳代后性狀和基因不可逆丟失。本研究擬以CR 技術培養的患者來源的原代肺癌細胞（conditionally reprogrammed lung cancer cells，CRLCs）為模型，研究扁塑藤素聯合順鉑對其增殖、遷移、凋亡的影響，并探討KEAP1-NRF2∕HO-1 信號通路在扁塑藤素增強順鉑對CRLCs 的抗腫瘤作用的潛在分子機制，以期為肺癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器 DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素∕鏈霉素雙抗購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；順鉑購自美國Sigma-Aldrich 公司；Y-27632 購自瑞士Enzo 公司，0.25%胰酶消化液購自上海碧云天生物技術有限公司；KEAP1 兔單克隆抗體、NRF2 兔單克隆抗體、HO-1兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；扁塑藤素購于上海同田生物技術有限公司。CO2細胞培養箱、酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；離心機購自德國Eppendorf 公司；熒光倒置顯微鏡購自德國Leica 公司。

1.2 細胞和組織來源 Swiss-3T3-J2 細胞購自美國ATCC 公司；共獲取中山大學附屬第一醫院2020年9-11月14例在胸外科接受手術治療或在呼吸科接受穿刺活檢的非轉移肺癌患者的腫瘤組織，其中男10 例，女4 例，年齡范圍37 ～73 歲，平均年齡59.7 歲。所有組織病理診斷均為肺腺癌。研究已得到中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準和患者及其家屬的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 組織處理及CRLCs 培養 剪碎組織塊，膠原酶Ⅳ消化液消化組織碎塊，37 ℃恒溫水浴中震蕩解離，過濾去除殘留碎塊，離心去上清。細胞沉淀按文獻［12］操作流程與Swiss-3T3-J2 細胞在含有ROCK 抑制劑Y-27632 的F+Y 培養基于37 ℃，5%CO2條件下共培養。傳代和后續操作可用0.05%胰酶消化液去除3T3，再用0.25%胰酶消化液消化CRLCs。

1.3.2 扁塑藤素和順鉑的配制 DMSO 溶解扁塑藤素粉末，制成20 mmol∕L 的PRIS 溶液。生理鹽水溶解順鉑粉末，制成5 mmol∕L 的順鉑溶液。藥液分裝并于-20 ℃避光儲存。

1.3.3 MTS 實驗檢測細胞增殖 以3 000 個∕孔的細胞密度接種CRLCs 于96 孔板上，37 ℃，5%CO2過夜。分別用不同濃度的扁塑藤素、順鉑、Znpp（20 μmol∕L）處理細胞48 h。每孔加入10 μL的MTS工作液，置于37 ℃，5%CO2的培養箱孵育1 h，酶標儀于490 nm 波長處測定OD值，計算細胞活力。細胞活力計算公式：細胞活力（%）=（A實驗-A空白）∕（A對照-A空白）×100%。

1.3.4 Calcein-AM/PI 細胞雙染實驗檢測細胞活力 以3 000 個∕孔的細胞密度接種CRLCs 于96 孔板上，37 ℃，5%CO2過夜。扁塑藤素和順鉑分別或聯合處理細胞48 h。用含有2 μmol∕L Calcein-AM和1 μg∕mL PI 的PBS 于37 ℃，5%CO2染色30 min。熒光顯微鏡拍照。

1.3.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 扁塑藤素和順鉑分別或聯合處理細胞24 h，消化細胞，用無血清的DMEM 培養基重懸，以5 × 104個∕孔的細胞密度接種于無或有Matrigel 膠覆蓋的Transwell 上室，下室加入含20%FBS 的F+Y 培養基，37 ℃，5%CO2培育24 h（遷移）或48 h（侵襲）。棉簽擦去上室細胞，4%PFA 室溫固定15 min，0.1%結晶紫染色30 min，拍照；33%乙酸洗脫，酶標儀于590 nm 波長處測定OD值，計算細胞遷移和侵襲的數量。

1.3.6 Annexin V-APC 流式細胞凋亡術檢測細胞凋亡 以20 × 104個∕孔的細胞密度接種CRLCs 于6 孔板上，37 ℃，5%CO2過夜。扁塑藤素和順鉑分別或聯合處理細胞24 h。收集細胞，加入500 μL的Binding Buffer 懸浮細胞，加入5 μL 的Annexin V-APC 染液混勻，室溫避光反應10 min，流式細胞儀在激發波長633 nm，最大發射波長660 nm 條件下進行檢測。

1.3.7 qRT-PCR 檢 測mRNA 水 平 用RNeasy Mini Kit（QIAGEN，Hilden，Germany）提取總RNA。用cDNA 反轉錄試劑盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）對每個樣本的總RNA（300 ng）進行反轉錄。用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）通過CFX96TM實時PCR 檢測系統完成qRT-PCR 擴增。所有操作基于制造商的說明進行。以GAPDH 為內參將數據歸一化處理，用2-ΔΔCT方法計算相對表達量。

1.3.8 Western blot檢測細胞表達水平 用5 mmol∕L ROS 清除劑NAC 或30 μmol∕L NRF2 激活劑tBHQ預處理細胞60 min，再用藥物處理細胞24 h；用20 μmol∕L HO-1 抑制劑Znpp 單獨或聯合藥物處理細胞24 h。加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，于冰上搖動裂解30 min，細胞刮刮下細胞，低溫高速離心，收集上清，BCA 檢測試劑盒對蛋白進行定量，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸變性。蛋白質樣品（30 μg）經SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，轉移到PVDF 膜上。室溫下用5%BSA封閉1 h 后，與一抗在4 ℃下孵育過夜。TBST 洗膜，室溫下用HRP 連接二抗孵育1 h，TBST 洗膜，顯影儀檢測蛋白表達。

1.3.9 ROS 的測定 以4 000 個∕孔的細胞密度接種CRLCs 于96 孔板，37 ℃，5%CO2過夜。5 mmol∕L NAC 預處理細胞60 min 后，扁塑藤素和順鉑分別或聯合處理24 h。30 μmol∕L DCFH-DA 避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡拍照。DCF 的熒光強度用多模式讀板儀測定，激發和發射波長為488 nm。

1.3.10 線粒體膜電位的測定 扁塑藤素和順鉑分別或聯合處理12 h，5 μmol∕L JC-1 孵育30 min，倒置熒光顯微鏡拍攝熒光圖像。5 mmol∕L NAC 預處理細胞60 min 后，扁塑藤素和順鉑分別或聯合處理24 h，收集細胞，用含20 nmol∕L 的DiOC6 的PBS 重懸，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀在激發波長482 nm，發射波長504 nm條件下進行檢測。

1.4 統計學方法 每個實驗至少重復3 次。使用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，計量資料表示為均值±標準差，比較用單因素方差分析或t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 扁塑藤素提高順鉑對CRLCs的細胞毒性 MTS實驗結果顯示，扁塑藤素和順鉑分別對CRLCs的細胞活力產生抑制且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1A、B）。除了1 μmol∕L扁塑藤素和8 μmol∕L順鉑聯合組，與單藥組相比，扁塑藤素聯合順鉑顯著抑制了CRLCs 的細胞活力，2 μmol∕L 扁塑藤素和6、8 μmol∕L 順鉑聯合組的抑制作用最強（P＜0.01，圖1C、D）。Calcein-AM∕PI 雙染結果顯示，單藥組CRLCs 呈Calcein-AM 陽性染色（綠）多而PI 陽性染色（紅）少，而扁塑藤素和順鉑聯合處理后，細胞呈PI 陽性染色多而Calcein-AM 陽性染色少（圖1E）。

圖1 扁塑藤素提高順鉑對CRLCs 抗增殖活力和細胞毒性Fig.1 PRIS enhances the anti-proliferative effect and cytotoxicity of cisplatin on CRLCs

2.2 扁塑藤素提高順鉑對CRLCs 的遷移和侵襲抑制作用 Transwell 遷移和侵襲實驗結果顯示，與單藥組相比，扁塑藤素聯合順鉑能夠顯著降低CRLCs 的遷移和侵襲的數量（P＜0.01，圖2）。

圖2 扁塑藤素增強順鉑對CRLCs 遷移和侵襲抑制的作用Fig.2 PRIS enhances inhibitory effect of cisplatin on migration and invasion of CRLCs

2.3 扁塑藤素提高順鉑對CRLCs 的凋亡誘導作用 Annexin V-APC 流式細胞凋亡結果顯示，與單藥組相比，扁塑藤素聯合順鉑能夠明顯增加細胞凋亡數（P＜0.01，圖3A、B）。Western blot結果顯示，相比于單藥組，扁塑藤素聯合順鉑可顯著誘導細胞色素C 釋放，增加線粒體凋亡標志物caspase-9、caspase-7、caspase-3 和Bax∕Bcl-2 的表達（P＜0.01，圖3C、D）。

圖3 扁塑藤素增強順鉑對CRLCs 細胞凋亡的誘導Fig.3 PRIS sensitizes cisplatin-induced apoptosis of CRLCs

2.4 扁塑藤素增加順鉑誘導的CRLCs 內ROS 累積和線粒體功能障礙 ROS 檢測結果顯示，相比于單藥組，扁塑藤素聯合順鉑顯著增加了ROS 在CRLCs 中的累積（P＜0.01，圖4A、C）。線粒體膜電位（MMP）檢測結果顯示，相比于單藥組，扁塑藤素聯合順鉑能夠顯著降低CRLCs 中MMP 的水平（P＜0.01，圖4B、E）。 ROS 清除劑NAC 預處理結果表明，NAC 預處理能夠削弱扁塑藤素和順鉑誘導的ROS 累積（P＜0.01，圖4D），抑制扁塑藤素和順鉑誘導的MMP 降低（P＜0.01，圖4F）。

圖4 扁塑藤素增強順鉑誘導的CRLCs 內ROS 累積和線粒體功能障礙Fig.4 PRIS enhances cisplatin-induced accumulation of ROS and dysfunction of mitochondria in CRLCs

2.5 扁塑藤素通過抑制KEAP1-NRF2/HO-1 信號通路增強順鉑誘導的細胞凋亡 Western blot 和qRT-PCR 結果顯示，相比于對照組和單藥組，扁塑藤素聯合順鉑顯著下調了CRLCs 內KEAP1，NRF2，HO-1的表達以及NRF2，HO-1的mRNA水平（圖5AC，P＜0.01）。NRF2 激活劑tBHQ 預處理結果顯示，tBHQ 顯著提高了NRF2 和HO-1 蛋白表達水平，扁塑藤素聯合順鉑能夠抑制tBHQ 對NRF2 和HO-1 的激活作用（圖5D）。HO-1 抑制劑Znpp 處理后，Western blot 結果顯示，Znpp 能夠增加扁塑藤素聯 合 順鉑上 調 的caspase-3 和Bax∕Bcl-2 表達水 平（圖5E、F，P＜0.01）；MTS 實驗結果顯示，Znpp 能夠增強扁塑藤素聯合順鉑的細胞活力抑制作用（圖5G，P＜0.01）。此外，NAC預處理削弱了扁塑藤素聯合順鉑提高的caspase-9，caspase-3，Bax∕Bcl-2表達水平（P＜0.01，圖5H、I）。

圖5 扁塑藤素聯合順鉑對KEAP1-NRF2∕HO-1 信號通路的影響Fig.5 Effects of PRIS and cisplatin on KEAP1-NRF2∕HO-1 signaling pathway

3 討論

耐藥性嚴重影響了順鉑在肺癌治療中的應用。天然化合物不僅可以單獨產生抗腫瘤作用，還可逆轉腫瘤細胞對順鉑產生的耐藥作用［7］。利用條件性重編程（CR）技術體外穩定、長期培養原代肺癌細胞，能夠保留患者腫瘤的遺傳學特性，為肺癌治療提供藥物篩選平臺［13］。在前期研究中［14］，筆者應用CR 技術建立了CRLCs，證明了扁塑藤素能通過EphB4∕CDC42∕N-WASP 信號通路誘導線粒體損傷和內質網應激，導致CRLCs 死亡。免疫熒光、免疫細胞化學結果顯示，CRLCs 保留了包括CK7、CEA、TTF-1 在內的多種肺腺癌惡性上皮細胞特征；STR 分析表明，細胞培養的早、中、晚期過程中，在9 個表達位點顯示一致性。本研究結果進一步顯示，扁塑藤素和順鉑分別能以劑量依賴的方式抑制CRLCs 的細胞活力，扁塑藤素能增強順鉑對CRLCs 的抗增殖能力和細胞毒性。此外，扁塑藤素能增強順鉑抑制CRLCs 遷移和侵襲的能力。這與扁塑藤素對肺癌細胞H1299 毒性作用一致［10］。

誘導凋亡是藥物發揮抗癌活性的重要途徑，涉及細胞色素C、caspase-9、caspase-8、caspase-3、Bcl-2 家族等蛋白的一系列生物學過程［15］。在本研究中，扁塑藤素能增加順鉑誘導的凋亡細胞數量和凋亡相關蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3和Bax∕Bcl-2 的表達。這些結果表明，扁塑藤素能增加順鉑誘導的凋亡作用。

扁塑藤素作用腫瘤細胞會產生過量ROS，誘導線粒體膜通透性上升，表面形成孔洞，進而釋放細胞凋亡因子，發生級聯反應使細胞死亡［16］。扁塑藤素誘導的過量ROS 也會導致內質網應激，使未折疊蛋白累積超過細胞調節限度，引起細胞死亡［8］。扁塑藤素還能通過ROS 激活ASK1∕JNK 信號通路發揮抗癌作用［17］。本研究結果顯示，扁塑藤素聯合順鉑能顯著增加細胞內ROS 的水平，降低線粒體膜電位，而這些作用可以被ROS 清除劑NAC 阻斷。這提示，扁塑藤素聯合順鉑能夠通過顯著抑制氧化應激誘導細胞凋亡。

當細胞處于氧化應激狀態時，NRF2 與KEAP1解離，轉位進入細胞核，與小Maf 蛋白形成異二聚體，和抗氧化反應元件（ARE）結合，從而調控包括HO-1 在內的多種蛋白的表達［18］。HO-1 是血紅素降解的限速酶，與細胞抗炎和抗凋亡作用有關［19］。NRF2 能增加下游HO-1 的表達，抑制血紅素和Fbxo22 介導的Bach1 降解，促進肺癌的轉移［20］。抑制HO-1 或敲低NRF2 能夠增強順鉑對喉部鱗狀細胞癌細胞的抗癌作用，增加細胞內ROS 水平和細胞死亡［21］。本研究結果顯示，扁塑藤素增強了順鉑誘導的ROS 穩態的破壞，一方面增加了ROS 在細胞中的累積，另一方面又抑制了細胞氧化應激的機制，可能通過調控KEAP1-NRF2∕HO-1 信號通路引起ROS 超載，增強順鉑誘導的細胞凋亡。

本研究結果為扁塑藤素用于順鉑的化療增敏及發現新的腫瘤耐藥∕逆轉耐藥相關基因提供了實驗數據和理論依據。因獲取的臨床肺癌樣本數量有限，故無法對樣本根據臨床信息進行分組，獲取不同亞組間的藥物敏感性和分子調控的差異。后續將擴大樣本量，按肺癌分子亞型分組、癌細胞分級等因素進行樣本匹配后研究，盡量減少因肺癌分子分型等不同而導致的研究結果差異。