miR-223調控NLRP3∕Caspase-1通路在氯胺酮誘導發育期大鼠海馬神經元焦亡中的作用

張洪江 李樹霞 翁洪亮

臨沂市中心醫院1麻醉科，2病理科（山東臨沂 276400）

氯胺酮作為N-甲基-D-天冬氨酸受體的非競爭性阻斷劑，可抑制神經干細胞增殖，造成大腦神經元變性與凋亡［1］。有研究表明氯胺酮能夠通過激活NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（nod-like receptor pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）∕含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）途徑誘導海馬細胞凋亡［2］。NLRP3∕Caspase-1 通路其激活可誘導細胞焦亡的發生。微小RNA-233（miR-223）參與未成熟神經元的分化，并可通過調控谷氨酸受體發揮神經保護作用［3］。研究發現miR-223 可通過抑制NLRP3 表達來抑制熱性驚厥大鼠海馬組織NLRP3∕Caspase-1信號通路的激活，從而抑制神經元凋亡［4］。本研究意在探究miR-223 是否可通過調控NLRP3∕Caspase-1 通路改善氯胺酮誘導的發育期大鼠海馬神經元焦亡，以期為氯胺酮誘導的神經損傷的治療機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 福建醫科大學所購買的7日齡雄性SPF 級SD 大鼠50 只，許可證：SCXK（閩）2016-0002，泉城省實驗室適應性飼養1周后（光照12 h∕d），于試驗前夕進行禁食（12 h）。

1.2 主要試劑 HRP-IgG抗體、兔抗NLRP3、β-actin、GSDMD-N 抗體（貨號：ab6721、ab214185、ab8227、ab215203，Abcam）；兔抗cleaved Caspase-1 抗體（貨號：AF4022，Affinity Biosciences）；白介素18（Interleukin 18，IL-18）、白介素1β（Interleukin 1β，IL-1β）試劑盒（貨號：SEKH-0028、SEKR-0002，北京索萊寶科技有限公司）；全自動凝膠成像分析系統ZF-288（上海金鵬分析儀器有限公司）；Bio-Rad 伯樂CFX Connect 熒光定量PCR（上海土森視覺科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組與處理 大鼠分為對照組、氯胺酮組、agomir-NC 組、agomir-223 組、agomir-223+BAY11-7082 組（10 μmol∕L NLRP3 抑制劑BAY11-7082）［5］，10只∕組。除對照組外大鼠腹腔注射氯胺酮（80 mg∕kg）后，左側側腦室海馬區注射生理鹽水（4 μL），agomir-223+BAY11-7082 組并注射抑制劑，對照組大鼠腹腔及左側側腦室海馬區均注射等量生理鹽水［6］。

1.3.2 空間探索實驗 平臺設于第三象限，大鼠面朝池壁于第一象限下水，記錄60 s 內大鼠尋找到平臺的時間及軌跡，為期5 d 訓練（1 次∕d）。于第6 d 撤掉平臺，記錄大鼠60 s 內潛伏期、第三象限停留時間及穿越次數，n=10。

1.3.3 HE 染色 空間探索實驗結束后取大鼠（5 只）海馬組織浸泡于4%多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋后連續進行切片（4 μm），再根據HE 染色試劑盒進行染色，脫水、封片后光鏡下觀察。

1.3.4 qRT-PCR 檢測大鼠海馬組織中miR-223 表達水平 取剩余5 只大鼠分離出海馬組織，一部分提取總RNA，檢測其純度和濃度，2-ΔΔCt計算miR-223 表達，n= 5，另兩部分分別用于ELISA 實驗及Western blot 實驗。

1.3.5 TUNEL 染色 石蠟切片孵育后進行DAB顯色、蘇木精復染、封片，光鏡下選取5 個視野觀察并拍照（n= 5），細胞計數（凋亡細胞呈現棕褐色），凋亡指數（apoptotic index，AI）（%）=（凋亡細胞∕總細胞）×100%。

1.3.6 ELISA 檢測大鼠海馬組織中IL-1β 及IL-18水平 ELISA 法測定各組1.3.4 所得海馬組織中IL-1β 及IL-18 水平（n=5）。

1.3.7 Western blot 檢測大鼠海馬組織中NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 的表達情況 在1.3.3所得海馬組織中加入裂解液，根據BCA法對蛋白濃度進行定量，蛋白樣品（30 μg∕孔）加入SDSPAGE凝膠中進行垂直電泳，轉膜后進行牛血清白蛋白封閉（5%），孵育兔抗NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N、β-actin（1∶1 000）抗體過夜（4℃）后孵育二抗（1∶1 000）2 h，加入ECL 顯影液后在蛋白凝膠成像儀中顯影觀察，Image J 分析蛋白條帶灰度值并計算含量（n=5）。

1.3.8 統計學方法 SPSS 18.0 對所有計量資料分析處理，以（）表示，ONE-WAY ANOVA 分析進行多組間計量資料比較，進一步兩兩比較使用SNK-q檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠海馬組織中miR-223 表達水平 與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬中miR-223 水平降低（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組miR-223 水平增加（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠海馬組織中miR-223 表達水平Tab.1 Expression level of miR-223 in rat hippocampus±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

分組對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值miR-223 1.00±0.04 0.36±0.05a 0.35±0.04a 0.87±0.10abc 0.86±0.08abc 107.998＜0.001

2.2 miR-223 對大鼠認知功能的影響 與對照組相比，氯胺酮組大鼠潛伏期增加，穿越平臺次數及第三象限停留時間占比降低（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組潛伏期降低，穿越平臺次數及第三象限停留時間占比增加（P＜0.05）；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組潛伏期降低，穿越平臺次數及第三象限停留時間占比增加（P＜0.05），見表2。

表2 miR-223 對大鼠認知功能的影響Tab.2 Effect of miR-223 on cognitive function in rats ±s

表2 miR-223 對大鼠認知功能的影響Tab.2 Effect of miR-223 on cognitive function in rats ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

分組對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值潛伏期（s）9.41±2.01 45.76±12.38a 43.75±11.40a 20.08±5.32abc 12.06±3.11abcd 46.500＜0.001穿越平臺次數（次）3.52±0.34 1.01±0.32a 1.05±0.34a 2.29±0.40abc 2.99±0.26abcd 113.803＜0.001第三象限停留時間占比（%）33.52±4.85 11.24±3.90a 12.15±2.97a 21.25±4.38abc 29.22±3.02abcd 65.390＜0.001

2.3 大鼠海馬組織病理學觀察 對照組大鼠海馬組織神經元排列整齊、結構完整、核膜核仁清晰可見；氯胺酮組大鼠海馬神經元出現變性壞死現象、細胞間隙增加、間質與膠質細胞腫脹明顯；與氯胺酮組相比，agomir-NC 組大鼠海馬組織病理學程度無顯著變化，agomir-223 組上述現象得到改善；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組大鼠海馬神經元神經元細胞得到進一步改善，見圖1。

圖1 大鼠海馬組織病理學觀察（×200）Fig.1 Histopathological observation of rat hippocampus（×200）

2.4 miR-223 過表達對大鼠海馬神經元凋亡的影響 與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬神經元AI增加（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組AI降低（P＜0.05）；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組AI 降低（P＜0.05），見表3、圖2。

圖2 miR-223 過表達對大鼠海馬神經元凋亡的影響（×200）Fig.2 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats

表3 miR-223 過表達對大鼠海馬神經元凋亡的影響Tab.3 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats ±s

表3 miR-223 過表達對大鼠海馬神經元凋亡的影響Tab.3 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

分組對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值AI（%）3.24±0.26 38.46±12.42a 36.12±10.75a 20.48±2.79abc 10.70±1.51abcd 21.255＜0.001

2.5 miR-223 過表達對大鼠海馬中IL-18、IL-1β水平的影響 與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬中IL-18、IL-1β 水平增加（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組IL-18、IL-1β 水平降低（P＜0.05）；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組IL-18、IL-1β 水平降低（P＜0.05），見表4。

表4 miR-223過表達對大鼠海馬中IL-1β及IL-18水平的影響Tab.4 Effects of miR-223 overexpression on the levels of IL-1β and IL-18 in rat hippocampus ±s

表4 miR-223過表達對大鼠海馬中IL-1β及IL-18水平的影響Tab.4 Effects of miR-223 overexpression on the levels of IL-1β and IL-18 in rat hippocampus ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

組別對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值IL-1β（pg∕mL）23.12±7.01 133.71±12.08a 128.95±10.86a 69.75±5.08abc 40.04±3.53abcd 181.734＜0.001 IL-18（pg∕mL）20.75±6.06 119.75±11.28a 114.84±8.30a 68.11±6.07abc 45.13±3.46abcd 165.627＜0.001

2.6 miR-223 過表達對大鼠海馬組織中焦亡相關蛋白表達的影響 與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬中NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 水平增加（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 水 平 降 低（P＜0.05）；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMDN 水平降低（P＜0.05），見表5、圖3。

圖3 miR-223 過表達對大鼠海馬組織中焦亡相關蛋白表達的影響Fig.3 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus

表5 miR-223 過表達對大鼠海馬組織中焦亡相關蛋白表達的影響Tab.5 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus ±s

表5 miR-223 過表達對大鼠海馬組織中焦亡相關蛋白表達的影響Tab.5 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

組別對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值NLRP3∕β-actin 0.42±0.07 1.20±0.15a 1.16±0.19a 0.93±0.10abc 0.69±0.08abcd 33.714＜0.001 GSDMD-N∕β-actin 0.53±0.05 1.32±0.20a 1.30±0.18a 1.10±0.15acb 0.84±0.11abcd 25.530＜0.001 cleaved Caspase-1∕β-actin 0.61±0.09 1.45±0.23a 1.46±0.20a 1.23±0.22acb 0.93±0.10abcd 20.841＜0.001

3 討論

氯胺酮等麻醉劑的使用會造成新生兒腦損傷，從而導致其成長期行為的改變［3，7］。氯胺酮可促進動物和人類大腦神經元的死亡，氯胺酮誘導的神經毒性的關鍵機制是引發神經元凋亡、壞死［3，8-10］。miRNA 可通過調控基因表達來參與細胞的生理病理過程，以及多種疾病的發生［4，11］。研究發現miR-223 在過氧化氫處理的海馬神經元表達下調，右美托咪定可通過促進miR-223 表達來抑制過氧化氫誘導的神經毒性作用［3］。miR-223-3p 過表達的間充質干細胞的外泌體可改善腦缺血大鼠學習與記憶能力，抑制炎癥反應及神經功能損傷［12］。miR-223 過表達可通過抑制NLRP3 炎性體來保護氧化低密度脂蛋白刺激的人血管內皮細胞免于細胞焦亡［13］。本研究發現miR-223 過表達可降低氯胺酮誘導發育期大鼠潛伏期、海馬組織病理學程度、神經元凋亡、IL-18、IL-1β，增加穿越平臺次數、第三象限停留時間占比，該結果表明，

miR-223 過表達可改善氯胺酮誘導的發育期大鼠的認知能力及海馬組織神經元損傷，抑制炎癥反應，從而起到神經保護作用。

氯胺酮已被發現可通過激活Caspase-1 依賴性細胞焦亡來誘導海馬細胞凋亡［14］。NLRP3 可被某些危險信號激活，通過募集Caspase-1 并與其形成炎性小體使其活化，誘導GSDMD裂解，形成細胞焦亡標志GSDMD-N，破壞細胞膜，使IL-18 及IL-1β分泌到細胞外，造成細胞焦亡和炎癥反應，抑制NLRP3∕Caspase-1 激活可抑制細胞焦亡［15］。研究發現，電針治療可以通過促進miR-223 表達來抑制NLRP3 水平，從而減輕神經炎癥，在大鼠動脈閉塞中起到神經保護作用［16］。miR-223 高表達可通過抑制NLRP3-Caspase-1 信號通路的激活來提高熱性驚厥大鼠學習記憶能力，同時抑制海馬神經元的損傷［5，17］。本研究發現，miR-223 過表達可降低NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 表達水平，和前人研究結果相似［15］，除此之外抑制該通路激活可進一步加強miR-223 過表達對氯胺酮誘導的發育期大鼠海馬神經元焦亡的改善。該結果表明，miR-223 過表達可有效抑制氯胺酮誘導的發育期大鼠海馬神經元焦亡，并且，其發揮的神經保護作用可能與其抑制NLRP3∕Caspase-1通路有關。

綜上所述，miR-223 過表達可能通過抑制NLRP3∕Caspase-1 通路來減輕氯胺酮誘導的發育期大鼠海馬神經元焦亡，從而起到神經保護作用。本研究不僅為氯胺酮誘導海馬神經損傷的治療提供有效的治療靶點，還對其發生機制研究具有重要意義。但本研究未對miR-223在其他通路中的調控作用進行探究，因此這為下一步的研究提供了方向。