穩定同位素技術在水產品養殖方式鑒別中的研究與應用

鄭 丹，夏珍珍，彭西甜，周有祥，彭立軍

(湖北省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，湖北省農產品營養品質與安全重點實驗室，武漢 430064)

近年來隨著漁業綜合生產能力的迅速提高，我國水產品的產量進入了高速增長期，部分水產品供應得到了極大的滿足。水產品行業在追求產量的過程中，往往存在投入品使用不規范的問題，使得水產行業暴露出一系列食品安全問題，如2006年爆發的多寶魚()中氯霉素、孔雀石綠、硝基呋喃及代謝物等多種漁藥殘留超標事件。為了緩解水產品供應和市場需求的矛盾關系，國家提出了農業供給側改革，積極對漁業進行轉型升級，推進以犧牲環境為代價的粗放養殖方式向生態化可持續性的養殖方式轉變。水產品的生產方式(如野生狀態、生態化養殖和網箱養殖等)的轉變不僅對水產品的質量安全和營養品質具有積極的影響，也促進了生態資源的可持續利用。

另一方面，在大部分水產品產量滿足多數人日常飲食消費的同時，人們對水產品的需求也逐漸從數量向質量轉變。具有較高營養價值的海洋魚類如三文魚()、比目魚等品種，以及更注重養殖生態環境的野生魚類，在市場上的供應相對緊缺。物以稀為貴，這些海魚、野魚、生態魚類的供應緊張抬高了它們的市場價格。為了保證消費者權益，歐盟關于漁業產品第1379/2013號條例規定，水產品標簽中應正確標明魚種、地理來源和養殖方式等信息，即實行水產品追溯標簽制。為了填補市場缺口，水產行業的以次充好、以假亂真的現象屢見不鮮，這類消費欺詐行為擾亂了正常的市場秩序，使得消費者和合法商家的權益受到侵害，因而對水產品的養殖方式進行溯源具有重要的現實意義。

目前，可用于水產品溯源分析的指標包括化學組分、感官特性、遺傳譜圖、礦物元素和同位素等，應用的主要儀器手段包括光譜法、核磁共振法、酶聯免疫、基因檢測、色譜和質譜等。其中，穩定同位素分析技術在溯源和摻假鑒別方面有著較好的優勢，目前已被應用于農產品和水產品領域。農產品和水產品中穩定同位素信息涵蓋了其生長環境、地理位置和營養級等多種信息，物品體內的穩定同位素比的差異可作為其“指紋圖譜”，以精準區分物品的不同。穩定同位素分析通過對生態系統中相關物種的分析，可以充分了解不同環境模式下生物的攝食特點及其穩定同位素組成。因而，這一技術被廣泛地應用于植物性和動物性食品的產地以及飼養方式的研究。該文從水產品養殖方式的角度入手，重點闡述了穩定同位素技術在水產品養殖方式鑒別的研究現狀。一方面，按照水產品種類的不同，分別從海水產品和淡水產品的角度闡述了穩定同位素技術在養殖方式鑒別中的應用現狀。另一方面，從鑒別技術手段的角度，闡述了穩定同位素在漁業養殖方式鑒別方面的優勢和不足，以及為提高鑒別準確率而采用的輔助技術和多元統計策略。

1 水產品養殖現狀

由于水文地理條件(水文特征、藻屑和沉積物等)以及養殖方式的不同，水產品的營養成分會隨之發生改變，因而水產品的品質好壞極大地依賴于產地及養殖方式。目前，我國評價水產品質量的標準體系主要是參照農產品的無公害產品、綠色產品、有機產品和地理標志產品的“三品一標”認證體系。無公害水產品是指無污染、無毒害、安全優質的水產品，是進入市場的基本準入條件；綠色水產品是指優良生態環境、按照綠色食品標準生產、實行全程質量控制并獲得綠色食品標志使用權的安全、優質食用水產品及相關加工產品；有機水產品是指在生產過程中不使用人工合成的肥料、農藥、生長調節劑和飼料添加劑等可持續發展的產品，它強調加強自然生命的良性循環和生物多樣性；地理標志水產品是指產自特定地域，所具有的質量、聲譽或其他特性本質上取決于該產地的自然因素和人文因素，經審核批準以地理名稱進行命名的水產品。通過比較分析可知，無公害、綠色和有機產品的環境友好度依次增加，生產方式更加趨近于自然化、生態化的養殖方式，而地理標志產品具有很強的地域要求和人文特征。“三品一標”是國家推動的、以企業為主體的高度組織化的農產品質量評價方式，評價過程主要以安全指標為認證參數。隨著廣大人民群眾對水產品的需求由量到質轉變，“三品一標”認證的水產品無法定性或定量的描述其與產品品質的關系。人們普遍認為水地產的養殖方式和營養品質密切相關，如深海養殖比人工塘養的魚滋味更豐富，因而從養殖方式的角度來衡量的水產品的品質更具現實意義。

我國天然水域、人工水體和沿海港、塭都適合水產養殖。目前，養殖的水產種類繁多，包括魚類、甲殼類、貝類、爬行類和兩棲類等。對于海水養殖來說，除自然海域捕撈的方式外，養殖方式還包括傳統的港、塭養殖、現代漁業的池養、浮式網箱養殖、深水網箱養殖以及路基工廠化養殖等。養殖的品種從單一品種向多營養層級的綜合養殖方式轉變，多營養層級的綜合養殖實現了系統中營養物質在不同營養級之間的循環利用，降低了環境壓力，提高了水產品的品質，如加拿大構建的魚、貝、藻類的綜合種養模式。近年來，這一綜合養殖方式也在我國得到了大規模的推廣應用，如江蘇開展的灘涂貝類與紫菜的立體養殖方式、山東榮成海草床多營養層次綜合養殖等，開辟了魚、貝、藻和參生態高效的綜合養殖新途徑。

對于淡水產品，我國養殖產量位居世界首位，養殖方式可細分為池塘養殖、稻田養殖、圍欄養殖、網箱養殖和大水面漁業養殖等。其中池塘養殖占據主要地位，具體可細分為單養和混養兩種模式，單養模式多適合養殖鱖魚()、黃顙魚()、羅非魚()、南美白對蝦()等肉食和雜食性品種。而池塘混養模式更為普遍，適用于“青()、草()、鰱()、鳙()”四大家魚和鱖魚、黃顙魚、中華鱉()和河蟹等的多品種和不同比例的混合養殖。稻田養殖是將稻田生態系統與水產養殖相結合形成漁稻復合系統，現已形成了稻-魚、稻-蝦、稻-鱉、稻-蟹的綜合養殖方式。圍欄養殖、網箱養殖、大水面漁業適合在湖泊、水庫中養殖大宗淡水魚、河蟹和河蝦等。其中全國湖泊和水庫中的淡水養殖產品絕大多數符合有機、綠色水產品標準，大水域漁業也逐步由“高產”養殖向生態環保和天然餌料喂養的生態化漁業發展。

綜上可知，目前水產養殖方式呈現多樣化、生態化發展的特點，且已建立健全以企業為主體的水產品認證體系。因而，通過可靠的技術手段實現水產品養殖方式和質量水平的分類鑒別，對于提高生態漁業的價值、配置養殖結構、改善水產品品質以及實現漁業的綠色可持續發展具有十分重要的意義。

2 穩定同位素溯源技術

2.1 穩定同位素技術原理

同位素是指原子中質子數相同、中子數不同的核素，有放射性同位素和穩定同位素之分。其中穩定同位素不受半衰期的影響，且無放射性危害。雖然穩定同位素之間化學性質無顯著的差異，但受環境影響的同位素分餾效應非常適合用于長時間的產品示蹤實驗。穩定同位素在自然界含量極低，用絕對量表達同位素的差異比較困難，因而國際上公認使用相對量來表示同位素的富集程度，計算公式為：

δ=(/-1)×1 000‰

其中為樣品中測得的重同位素與輕同位素的豐度比值。

穩定同位素技術可用于水產品養殖方式的鑒別與溯源，其通過水產品中穩定同位素的比值與可能的食物來源的穩定同位素比值做比較，從而推斷可能的食物來源，攝食種類比例、食物季節變化和時空變化等，從而鑒別出水產品的養殖方式和產品品質。一般用于鑒別養殖方式的穩定同位素包含碳13/碳12(C/C)、氫2/氫1(H/H)、氧18/氧16(O/O)、氮15/氮14(N/N)、硫34/硫32(S/S)和鍶87/鍶86(Sr/Sr)六種。水產品中的δC、δN同位素可以反映攝食種類的變化，δH、δO同位素反映水產品養殖環境的溫度、海拔和降水的變化特征，δS、δSr同位素則主要反映養殖水體中地質環境特征。因此，可通過水產品中一組或多組同位素特征鑒別其養殖方式。

2.2 穩定同位素技術的特點

隨著分析對象的深入，穩定同位素技術用于溯源分析可以分為全樣品穩定同位素分析、特性化合物穩定同位素分析和位置穩定同位素分析三類，這些方法的分析目標由宏觀分析對象向微觀特定化合物深入，進而能夠實現更為小尺度差異的鑒別與溯源，從而提高了鑒別的準確率。目前，常用做分析的特異性化合物包括單糖、有機酸、氨基酸、脂肪酸和揮發性小分子中δC、δN同位素，如通過市售果汁中有機酸和果糖等的δC同位素分析，GUYON等實現了市售果汁純度的鑒別；通過對不同來源的蝦夷扇貝()中多種單糖的δC、δN同位素分析，方志強等實現了蝦夷扇貝的來源分析，且相較于單一同位素分析提高了準確度；GREULE等測定香草醛分子以及香草醛甲氧基上的δC和δH，并將兩組δC和δH用散點圖分析，建立了判別香草醛摻假的區間。利用穩定同位素技術鑒別時，有時需要選取產品中的某一種或者幾種組分進行分析。此時，需要其他儀器的輔助，如高效液相色譜-穩定同位素比率質譜(HPLC-IRMS)和氣相色譜-穩定同位素比率質譜(GC-IRMS)等，將待測組分分離后檢測。此外，選擇適當基質的穩定同位素標準物質有助于提高鑒別溯源的有效性和準確度。

3 穩定同位素養殖方式鑒別的研究現狀

3.1 海水產品養殖方式鑒別

海水產品營養物質豐富，如不飽和脂肪酸含量較高，通常被認為具有比淡水魚類更高的營養價值。不同養殖方式下的海水產品品質存在較大差別，海水產品易受市場消費的追捧，經濟價值較高，冒充養殖方式以次充好的問題也較為突出，因而對海水產品養殖方式的鑒別與溯源非常必要。

3.1.1 甲殼類海產品

目前，穩定同位素溯源與鑒別已經廣泛應用于海水產品的貝類和蝦類等甲殼類海產品。一些典型的穩定同位素技術用于海水產品養殖方式溯源的文獻如表1所示。蔡星媛等利用穩定同位素技術，比較了筏養和底播兩種養殖魁蚶()方式的穩定同位素差異，發現δC、δN同位素值存在季節差異，但是隨季節變化趨勢相反，五月差異不明顯，九月筏養區魁蚶的δC、δN值均顯著高于底播區。這是由于兩者食物來源不同，筏養區魁蚶的食物主要來源于浮游植物，而底棲魁蚶的主要來源為底棲微藻，因而通過魁蚶中δC、δN穩定同位素值可鑒別其生產方式。ORTEA等通過δC、δN穩定同位素及鉛(Pb)、鎘(Cd)、砷(As)、磷(P)和硫(S)元素分析結合化學計量學探究了商品基圍蝦()的生產方式、產地和種類的鑒別，且生產方式和產地預測正確率達到100%，基圍蝦種類鑒別正確率達到93.5%。CARTER等從蝦的同位素和微量元素的數據發現，澳大利亞對蝦()的δC、δH同位素值和As、鋅(Zn)、鉀(K)要高于進口蝦。文中分析出現這種差異的原因可能是進口對蝦通常在水產養殖設施中飼養，并在澳大利亞銷售前冷凍，因而通過δC、δH同位素和微量元素差異可以實現澳大利亞對蝦與進口對蝦的區分。對于甲殼類產品，δC、δN穩定同位素具有較好的養殖模式和食物來源指征，甲殼類產品含有豐富的元素成分，輔助一些元素指標能更好地對養殖模式進行區分。

表1 海水產品養殖方式穩定同位素比較

3.1.2 海水魚類

(1)穩定同位素結合元素分析和組成分析

為了得到比較準確的溯源結果，除了單一的穩定同位素分析外，還會結合如脂肪酸、蛋白質和氨基酸等組成分析的手段。如，ROJAS等分別對10種野生和40種人工金尾海鯛()肌肉樣本的δC和δN同位素分析，發現兩種同位素提供了一種很好的區分標志，即野生海鯛的δN和δC分別為7.5‰～15.5‰和-19.1‰～-14.6‰，人工養殖的則為11.0‰～16.3‰和-23.3‰～-20.5‰。TURCHINI等通過穩定同位素結合形態學、脂肪酸和營養成分分析嘗試區分戶內循環、戶外浮籠和徑流循環三類漁場的鱈()，結果表明不同漁場間魚的δC、δN同位素與其飼料密切相關，δO同位素與水源密切相關，結合δC、δN、δO穩定同位素可以實現不同漁場鱈的有效區分，此外還發現通過脂肪酸、形態和組成分析等能夠很好地實現野生和養殖魚的區分。AURSAND等利用穩定同位素比率質譜、氣相色譜分析了安大略鮭()的魚油以及肌肉中脂質提取物的12種脂肪酸組成、H/H和C/C值，并通過核磁共振分析法分析了14個同位素簇H摩爾分數，結合多種組成和同位素數據，實現了野生安大略鮭以及其魚油制品的人工養殖和野生兩類生產方式的區分。DEMPSON等發現相較于人工養殖鮭，野生鮭中有顯著的N富集和C值減少的情況，其中野生鮭的δN、δC平均值分別為(12.75±0.38)‰和(-20.51±0.23)‰，人工養殖鮭的δN、δC平均值分別為(10.96±0.19)‰和(-19.25±0.17)‰，因而通過二者相結合可以有效實現野生和養殖鮭的區分。TREMBACZOWSKI等利用鮭魚鱗片中的δC、δS穩定同位素值的區別能夠很好地區分野生和養殖兩種生長方式的鮭魚，研究發現野生鮭的δC、δS同位素分別在-31～21‰和-13‰～7‰之間，飼養鮭魚則分別在在-22‰～29‰和11‰～26‰之間。SERRANO等分析了金頭鯛的白肉、紅肉、肝臟、鰓和性腺部分的δC、δN同位素，發現脫脂后養殖魚的δC同位素較野生的平均減少(2.9±0.4)‰，δN同位素較野生的平均多(1.5±0.2)‰，因而通過穩定同位素特征可以很好地將養殖和野生的金頭鯛區分開來。WANG等開發了一種新的基于氨基酸的同位素分析方法，通過分析不同魚的氨基酸同位素，不僅可以精確地區分野生、有機和傳統養殖的鮭魚群，還可以區分它們是以昆蟲還是大型藻類為食。在一個不斷開發新飼料蛋白和功能添加劑的行業，特異氨基酸同位素分析法是溯源三文魚和其他海水產品的一種很有前景的手段。

δC和δN同位素能夠更好的反映魚類產品在生命周期中攝食來源及代謝吸收后的情況，因而對于鑒別魚類產品的養殖模式具有很好的指示作用。同時為了提高區分度，特定組織和化合物成分中的同位素特征也進一步分析，如魚鱗、魚油以及魚肉中氨基酸中的同位素特征。整體以及細節部位的同位素特征結合魚類產品特有的蛋白質、脂肪酸和氨基酸這些主要的營養成分特征能夠對其養殖方式起到一個更為精準的區分，這種溯源模式背后機理值得我們進一步研究。

(2)多元統計輔助穩定同位素技術

在一些復雜情況下，不同養殖方式引起的同位素特征差異并不明顯，無法直接觀察到，往往需要借助統計學方法，因而需建立一些分類模型從而實現不同養殖方式的區分。如DOUGLAS等測定了不同養殖方式下金頭鯛的脂肪酸含量、魚油中的δC、δO同位素值、磷脂膽堿中的N同位素值和脂肪酸中δC同位素值，通過這些數據結合主成分分析可以區分野生的和養殖的金頭鯛。BUSETTO等分析了大鯪鲆()的δC、δN同位素比值和脂肪酸數據，單純地從這些數據上無法找到一個直觀的分類閾值，但結合現行判別分析和獨立軟模式類簇法的方法可以很好地實現野生和人工養殖的大鯪鲆的區分。FASOLATO等應用多元統計的方法，結合魚的生物量統計和魚肉組織中的脂肪酸組成、δC、δN同位素比值可以有效區分歐洲海鱸()的養殖方式。BELL等測定了不同養殖方式下鱸魚的總δC、δO同位素值和脂肪酸含量，另外通過特定化合物同位素分析測定了甘油δN、脂肪酸δC，結合這些數據與PCA方法可以用于野生鱸魚和養殖鱸的快速區分。THOMAS等通過分析171份鮭樣品的脂肪酸組成和穩定同位素特征，發現膽堿中的δN值和總魚油中的δO值可以很明顯的區分鮭的養殖方式，再結合亞油酸C18：2n-6所占脂肪酸的質量分數可以有效地判斷市場上野生鮭標簽使用是否恰當。GOPI等為了驗證穩定同位素是一種有效的鑒別海水產品來源的方式，選取了澳洲鱸和澳大利亞虎蝦()作為分析對象，通過他們的δC、δN穩定同位素實現了不同產地澳洲鱸魚和不同生產方式下澳大利亞虎蝦的區分，從而證明了穩定同位素適用于海水產品生產方式和產地的鑒別。此外，GOPI等將X射線熒光(XRF)掃描儀和穩定同位素結合，分析了尖吻鱸()穩定同位素和元素數據，將獲得的數據通過多元分析、隨機森林和現行判別等方法，建立統計模型用于生產方式和地理差異的預測，通過比較發現結合兩組數據建立的預測模型的正確率為81%，要高于單一數據建立的預測模型，因而多分析手段配合穩定同位素分析可以進一步提高魚類生產方式預測的準確度。

3.2 淡水產品養殖方式的鑒別

3.2.1 甲殼類淡水產品

淡水養殖的甲殼類產品多以蝦蟹為主，目前對于淡水甲殼類的穩定同位素溯源主要用于不同養殖模式下的食性區分。如周正等利用穩定同位素技術比較了稻蝦共作養殖方式和池塘精養模式下的食性和營養級差異，通過比較發現，共作模式下克氏原鰲蝦()的δC值介于-34.22‰～-25.34‰之間，δN值介于2.72‰～5.97‰，精養模式下克氏原鰲蝦的δC值介于-31.76‰～-26.38‰，δN值介于2.33‰～8.05‰之間，通過與養殖環境中的植物和浮游顆粒物的同位素值比較，可以計算出不同養殖方式下的蝦的營養級別，在精養模式下克氏原螯蝦的營養級為2.34，高于共作模式下的1.79。通過對比食物網結構參數發現，雖然不同養殖方式下克氏原螯蝦的生態空間利用率接近，但由于共作模式的食物網營養結構多樣性較高，群落的營養生態位范圍較寬，食物網的營養冗余程度較低，不同物種競爭激烈程度較低。與精養模式相比，稻蝦共作模式中克氏原螯蝦更偏向植食性。

3.2.2 淡水魚類

與海水魚不同，淡水魚的養殖方式更為多樣，養殖環境更為復雜，即使是同一種養殖方式，在不同地區由于環境、土壤、水源和氣候等因素的差別也會使產品品質存在顯著差異。穩定同位素技術在淡水產品養殖方式鑒別上的研究報道較少，如表2所示。CURTIS等分析了云斑狗魚()耳石中δC、δO穩定同位素比和鋇(Ba)、硼(B)、錳(Mn)、K、銣(Rb)、鈉(Na)、鍶(Sr)七種元素，結合這兩類參數能很好地實現野生狗魚和養殖狗魚的區分。SANTS-ANA等研究了野生和人工養殖的巴西淡水魚的化學組成和穩定同位素的季節性變化規律，通過比較不同季節淡水魚的蛋白質、水分、肥美度和同位素差異，發現在雨季養殖魚比野生魚有更好的營養狀況，且δN同位素要顯著富集，而旱季則沒有發現富集現象。此外，無論旱季還是雨季，養殖魚的δC同位素都觀察到了富集的現象。因此，利用δC、δN穩定同位素可以溯源巴西淡水魚的生產方式以及季節。劉志等通過分析鯉魚()魚磷的穩定同位素，區分了我國洞庭湖范圍內野生、湖泊養殖和池塘養殖的鯉魚，發現池塘養殖的鯉魚鱗片的C和N值相對富集于野生和湖泊養殖的鯉魚，造成這一現象的原因是池塘養殖鯉魚攝入的動物蛋白衍生飼料較野生和湖區養殖的鯉魚多，文中進一步通過魚鱗的穩定同位素數據和元素數據結合(PLS-DA)方法實現了三類湖區水產的區分。

表2 淡水產品養殖方式穩定同位素比較

我國淡水魚類大多都是混養模式，因而通過對淡水魚不同混養模式下的同位素特征進行分析，并結合其攝食來源和環境沉積物等的穩定同位素進行比對分析，可以揭示淡水產品的攝食類型和主要的食物來源，從而間接判定水產品的養殖方式。皮坤等通過對我國主要的淡水魚草魚和黃顙魚的池塘沉降物的δC、δN穩定同位素示蹤分析，以及沉降顆粒物的總氮、總碳、總有機碳以及總有機氮的特征分析，發現主養黃顙魚池塘顆粒沉降物中總氮、總碳、總有機碳以及總有機氮含量均顯著高于主養草魚池塘，主養黃顙魚和草魚池塘沉降顆粒物的δC平均值分別為-25.3‰和-25.4‰，δN同位素平均值分別為6.2‰和5.9‰。

3.3 穩定同位素在養殖方式鑒別中的應用特點

通過總結上述研究發現，穩定同位素在養殖方式的溯源中存在以下特點：(1)利用元素以δC、δN同位素為主，δH、δO、δS同位素為輔。目前，在養殖方式鑒別領域的應用研究多用δC、δN同位素，δC、δN同位素跟水產養殖的攝食來源有關，能極大地反映水產品攝食的種類。另外，水產品中的穩定同位素分析由總的穩定同位素特征向水產品中某一類化合物分子中的穩定同位素特征轉變。(2)多種分析手段相結合。單一的穩定同位素技術在野生和有機養殖水產品中進行溯源比較困難，需借助其他的技術手段共同分析，如元素分析、脂肪酸分析、氨基酸分析等。(3)需借助一定統計學方法。對于特定的鑒別，需要借助一些統計學方法建立定量的生產方式預測模型，目前用到的統計學方法主要有：多元統計分析、主成分分析、偏最小二乘判別分析等。在養殖方式鑒別研究中，對于除穩定同位素方法以外的分析方法、分析對象以及統計方法的補充都是為了提高生產方式鑒別的準確度。因而，提高準確率是鑒別的首要目標，但是在提高鑒別準確度的同時更應該分析同位素特征以及其他內含物成分與養殖方式的相關性聯系，從而揭示溯源機理。

4 結論與展望

綜上所述，穩定同位素技術已經成為水產品生產方式的一種有效的鑒別手段。目前的生產方式鑒別主要集中在海水產品，而淡水產品的生產方式鑒別研究較少。今后可從以下幾方面著手深入研究穩定同位素技術在水產品養殖模式鑒定方面的應用。(1)加強對淡水產品養殖的模式，尤其是復雜生態養殖方式的淡水產品整體的穩定同位素特征分布特征研究。(2)為了提高區分度，需加強對某個部位或某類化合物的同位素特征的研究，并將這類養殖方式的同位素特征之間的關系進行深度利用。(3)統計學方法對養殖方式鑒別起著至關重要的作用，但目前使用的統計學方法相對單一，需要盡可能豐富建模方法從而從數據挖掘的角度提高鑒別模型的預測效率。通過以上三方面的研究以期為生態化養殖方式生產農產品提供行之有效的技術監管或認證手段。