黑斑蛙歪頭病病原米爾伊麗莎白菌的分離、鑒定及特性分析

李川北，阮陳松杰，吳明波，徐洪森，蘇應兵

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025；2.武漢輕工大學動物科學與營養工程學院，武漢 430023)

黑斑蛙()屬兩棲綱無尾目蛙科側褶蛙屬，又稱黑斑側褶蛙，在我國廣泛分布于除海南、云南、西藏、青海和臺灣以外的各地區。黑斑蛙肉具有低脂肪、低膽固醇、高蛋白的優點，有較高的食用和藥用價值，是我國近年來養殖蛙類中的主要品種之一。其養殖具有投入少、產出高、周期短、效益高等特點，近年來我國黑斑蛙養殖業發展十分迅猛。然而，隨著黑斑蛙人工養殖規模的擴大，養殖環境出現惡化，加之不成熟的養殖技術，黑斑蛙的病害也逐年增多，給養殖戶造成巨大經濟損失。目前，已有致病性洛菲不動桿菌()、嗜水氣單胞菌()、氣單胞菌、肺炎克雷伯菌()、米爾伊麗莎白菌()、腦膜炎膿毒黃桿菌()和腦膜敗血伊麗莎白菌()等感染黑斑蛙后導致其嚴重死亡的報道。

蛙歪頭病，因蛙發病時頸部歪斜而得名，該病傳染性強，死亡率高，目前尚無穩定有效的治療方法，是蛙養殖過程中常見的疾病之一。2019年7月，湖北石首市大垸農場養殖黑斑蛙大面積死亡，病蛙出現典型的頭部變歪、單側或者雙側眼球渾濁發白和腹水癥狀，發病溫度為25～28 ℃，發病率達80%，死亡率高達90%。對病蛙腦、肝、脾和腎臟進行病原菌分離，并通過病原菌的形態特征、生理生化特性、16S rRNA基因測序與系統發育對分離菌株進行鑒定，確定該病原菌的種屬地位；然后通過人工感染試驗和組織病理學分析確定該病原菌的致病性；最后通過藥物敏感試驗分析該病原菌的藥物敏感性，以期為該病的臨床防治用藥提供科學指導和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蛙

患病黑斑蛙取自湖北省石首大垸農場，采集患有歪頭、單側或者雙側眼球渾濁發白和腹水癥狀的黑斑蛙，共20只，平均體重為(48.0±1.0)g；健康黑斑蛙購自荊州市棗林鋪黑斑蛙養殖基地，平均體重為(50.0±1.0)g，共140只，暫養于長江大學動科學院用于后續攻毒試驗。

1.1.2 主要試劑

LB固體和液體培養基購自青島海博有限公司，革蘭氏染色液和蘇木精伊紅染色液購自北京索萊寶科技有限公司，API 20E試劑盒購自法國梅里埃生化公司，甲醛、二甲苯、無水乙醇和固體石蠟等購自國藥集團化學試劑有限公司，藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司，Taq酶、dNTPs、細菌基因組提取試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，PCR擴增引物合成和擴增產物的測序均由武漢擎科創新生物科技有限公司完成。

1.1.3 主要儀器

光學顯微鏡購自奧林巴斯，PCR儀器購自SensoQuest，生物組織石蠟包埋機購自湖北安立信醫療實業有限公司，石蠟切片機購自德國徠卡。

1.2 病原菌分離純化

無菌條件下從病蛙腦、肝、脾和腎等部位，用無菌接種環取樣后劃線接種于LB固體培養基，28 ℃培養24 h，次日挑取平板上優勢菌落，LB固體培養基純化培養24 h，取單菌落培養后4 ℃保存備用。從腦、肝、脾和腎四種組織中均分離到菌落形態相同的優勢菌，選取腦組織中分離菌株為研究對象，暫命名為BSH3。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態學分析

將BSH3菌株劃線接種于LB固體培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察細菌菌落形態特征與顏色，測量菌落直徑大小。挑選單菌落用革蘭氏染色液進行革蘭氏染色后，顯微鏡觀察細菌染色特征。

1.3.2 生理生化特性分析

菌株BSH3的生理生化指標使用API 20E試劑盒進行檢測，操作方法詳見該試劑盒說明書，通過APIweb鑒定軟件判讀試驗結果，并參照伯杰氏細菌鑒定手冊中細菌生理生化指標進行確認。

1.3.3 分子生物學鑒定

將菌株從LB培養基上用蒸餾水洗脫下來，8 000離心10 min收集菌體。按細菌DNA提取試劑盒說明書抽提細菌基因組DNA，提取的總DNA即作為PCR擴增模板。用細菌通用性引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進行16S rRNA基因PCR擴增。PCR擴增產物送至武漢擎科生物科技有限公司測序，通過GenBank中的BLAST程序進行序列同源性分析。下載GenBank中相關細菌16S rRNA 基因序列，通過Clustal X軟件進行多重比對，用MEGA 6.0 軟件中鄰接法(neighbor joining，NJ)構建分子系統發育樹。

1.4 組織病理學觀察

取自然發病黑斑蛙的腦、肝、脾和腎組織(0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm)，置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h后，進行常規石蠟切片和HE染色，Olympus顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.5 人工感染試驗

健康黑斑蛙試驗前在50 cm×40 cm×30 cm的塑料筐中暫養2周，每框20只，共7框?？蛑屑尤肫貧馑蛊溲瓦^黑斑蛙背部，并放入一塊泡沫板。暫養和試驗期間水溫保持在25～28 ℃，定期換水。暫養前進行抽樣檢測，確定試驗用蛙不攜帶病原菌。

將分離純化的菌株BSH3接種于LB液體培養基28 ℃振蕩培養24 h后，8 000離心10 min沉淀菌體，去上清后用無菌PBS稀釋成濃度為1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU/mL的菌液。將黑斑蛙隨機分為6個感染組和1個陰性對照組，每組20只。采用大腿注射法進行人工感染，試驗組每只注射0.2 mL不同濃度菌懸液，對照組注射等體積的PBS。連續觀察8 d，每日早上9點和下午5點記錄試驗蛙的臨床癥狀及死亡情況，并將剛死亡蛙的腦組織再次進行細菌分離與鑒定。采用寇氏法計算菌株BSH3的半致死濃度(LC)。

1.6 藥物敏感試驗

采用紙片瓊脂擴散法檢測菌株BSH3藥物敏感性。首先將BSH3菌株接種于LB液體培養基，28 ℃振蕩培養24 h后，8 000離心10 min沉淀菌體，用無菌PBS稀釋菌體至0.5個麥氏濃度，取20 μL菌懸液均勻涂布于LB固體平板上，待菌液被吸收后，向培養基貼不同抗生素藥敏紙片，置于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h，測量抑菌圈直徑，并參照產品說明書判斷標準來判定結果。按相同方法每種藥敏紙片重復3次。

2 結果

2.1 患病黑斑蛙臨床癥狀

患病蛙的頭部出現向一側嚴重傾斜的癥狀(圖1a)，有些病蛙不僅具有歪頭癥狀同時也出現了單側或者雙側眼球渾濁發白的癥狀(圖1b、c)，另外部分病蛙出現腹部膨脹的癥狀(圖1d)，解剖發現蛙腹內有大量淺黃色腹水，肝臟充血腫大呈黃紅相間的花斑肝(圖e)，病蛙腸道內無食物，充滿透明狀液體(圖f)。

圖1 患病黑斑蛙病變特征

2.2 細菌形態特征

BSH3菌株在LB平板上28 ℃培養24 h后，可形成灰白色、圓形至橢圓形不等、中央微凸起、表面光滑、邊緣整齊，直徑在1～2 mm的小菌落(圖2a)。革蘭氏染色為革蘭氏陰性短桿菌，長1.0～2.0 μm，寬0.5～0.8 μm(圖2b)。

圖2 BSH3株形態學觀察

2.3 16S rRNA基因序列分析

通過PCR擴增和克隆測序獲得BSH3菌株的16S rRNA基因片段長度約為1 500 bp。將菌株基因序列在NCBI上進行BLAST在線對比，結果顯示，菌株BSH3與米爾伊麗莎白菌16S rRNA基因序列(登錄號：KY930330.1)的同源性達99.93%。下載GenBank中相關細菌16S rRNA基因序列，通過Clustal X軟件進行多重比對，用MEGA 6.0軟件中鄰接法(neighbor joining，NJ)構建分子系統發育樹(圖3)。結果顯示，菌株BSH3與米爾伊麗莎白菌處于一個進化分支上。

圖3 基于16S rRNA基因構建的菌株BSH3系統發育樹

2.4 細菌生化鑒定

生理生化結果顯示菌株BSH3能夠利用脲素、Kohn明膠、山梨醇、麥芽糖、乳糖、葡萄糖和甘露醇，不能利用鄰硝基苯-半乳糖苷、賴氨酸、鳥氨酸、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、色氨酸、丙酮酸鹽、肌醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖和木糖(表1)。

表1 病原菌BSH3的生理生化特性

2.5 組織病理學

患病黑斑蛙肝臟組織出現大量褐色色素沉積，發生空泡變性和纖維素樣變性(圖4a)；腎小管和腎小囊出現玻璃樣變形，有大量炎性細胞浸潤和出血現象(圖4b)；脾臟組織中發生空泡變性和玻璃樣變形，并伴有炎性細胞浸潤(圖4c)；腦基質水腫，膠質細胞增多，神經元細胞、膠質細胞周圍空隙變大，基質中存在空泡，伴有出血現象(圖4d)。

圖4 患病黑斑蛙組織病理學觀察

2.6 人工回歸感染試驗

菌株BSH3人工感染黑斑蛙后，蛙體出現不攝食，歪頭、白內障、失去定向運動能力等神經性損傷癥狀。菌株濃度為1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU/mL時，黑斑蛙的累計死亡率分別為100%、95%、85%、65%和25%。而注射濃度為1.0×10CFU/mL或PBS時，黑斑蛙在試驗期間沒有出現死亡。對病死蛙腦、肝、脾和腎等組織進一步進行細菌分離鑒定，經鑒定為米爾伊麗莎白菌()，與自然患病蛙細菌分離鑒定結果一致，表明米爾伊麗莎白菌是造成此次黑斑蛙歪頭病的病原菌。采用寇氏法計算該菌株對黑斑蛙的半數致死量(LC)為6.3×10CFU/mL(表2)。

表2 不同濃度分離菌株BSH3感染黑斑蛙死亡結果

2.7 藥敏試驗

菌株BSH3對23種抗菌藥物的藥敏試驗結果見表3，結果表明分離菌株對米諾環素、氟苯尼考、利福平和萬古霉素敏感，對氧哌嗪青霉素、羧芐西林、多西環素、復方新諾明、恩洛沙星和萘啶酸中度敏感，對青霉素G、阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢他啶、頭孢克洛、氨曲南、吡哌酸、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那、新霉素和多粘菌素B等多種藥物耐藥。

表3 菌株BSH3的藥敏試驗結果

3 討論

3.1 歪頭病病原及主要癥狀

歪頭病是蛙類養殖過程中危害較大的疾病之一，通常還伴有白內障、腹水等并發癥。不同患病個體表現出來的具體癥狀也有所不同，急性患病個體只表現出歪頭癥狀，不表現白內障和腹水等癥狀；而在慢性患病個體中，歪頭、白內障和腹水三種癥狀均可表現出來。導致病蛙出現急性和慢性感染的主要原因是細菌感染的部位不同，在急性歪頭病蛙中只能從腦部分離到大量病菌，而在出現三種癥狀的慢性病蛙可以同時從眼、腦、肝、腎和腹水等部位分離到相同致病菌。本實驗中，患病黑斑蛙臨床特征主要表現為食欲減退，歪頭，白內障和腹水等，這與Hu等報道的米爾伊麗莎白菌引起黑斑蛙歪頭病的結果一致。其中，歪頭和白內障具有代表性，可以作為臨床上診斷該病的重要依據。

在魚類和蛙養殖過程中均有白內障病的報道，但引起兩者出現白內障的病原存在差異。引起魚類眼球表面出現白內障的病原為寄生蟲，如復口吸蟲()的尾蚴和囊蚴等可以引起魚類白內障病。目前，已報道的棘胸蛙()、青蛙()、黑斑蛙()、棘腹蛙()、牛蛙()、虎紋蛙()、刺蛙()等蛙類白內障(歪頭)則均是由細菌引起。其中，主要是由伊麗莎白菌屬(spp.)的腦膜敗血伊麗莎白菌()所引起。

3.2 米爾伊麗莎白菌的致病性

米爾伊麗莎白菌為革蘭氏陰性桿菌，隸屬于黃桿菌科()伊麗莎白菌屬，廣泛分布于淡水和土壤中。2003年該菌首次從和平空間站冷凝水中被分離到。此后，研究發現該菌可引起人類腹膜炎、肺炎、腦膜炎、蜂窩組織炎、敗血癥和眼部感染等癥狀。米爾伊麗莎白菌可感染多種無尾類動物，在黑斑蛙、刺蛙、豹蛙()、樹蛙()和微蹼鈴蟾()等中均有發現，出現歪頭、白內障和腹水等癥狀，并導致大量患病死亡。本研究中，人工回歸感染試驗表明米爾伊麗莎白菌BSH3的半數致死量為6.3 × 10CFU/mL，具有較強的致病性。然而，Huang等研究中，米爾伊麗莎白菌的致死率相對偏低，說明不同分離株的致病力存在差異。

實驗對患病蛙腦、肝、脾和腎臟進行組織病理觀察，發現米爾伊麗莎白菌感染黑斑蛙后可引起蛙這些組織損傷。尤其是蛙腦基質輕度水腫，膠質細胞明顯增多，膠質細胞、神經元細胞周圍空隙增大，基質中有空泡。這與伊麗莎白菌引起蛙類腦部病理觀察結果是一致的。當蛙體質下降并受到病原侵害時，病原躲過了蛙體的免疫防御，在蛙體內定植并不斷繁殖，沿著某種路徑侵入大腦，造成大腦的各類炎癥和機能障礙，出現了歪頭、旋游、定向能力失調的癥狀。另外，病蛙肝、脾和腎臟出現變性、壞死和炎癥細胞浸潤等病變。由此可見，患病的黑斑蛙病灶并不僅僅局限于腦部，其他內臟器官也不同程度受到感染且更加嚴重，多器官壞死、衰竭最終加速了病蛙的死亡。本實驗中從病蛙的腦、肝、脾、腎組織中均分離到致病菌株，暗示病原菌是導致蛙組織損傷的原因。胡瑞雪從患病蛙腦組織分離到一株米爾伊麗莎白菌FL160902，該菌可引起蛙肝、脾、腎、腦不同程度的損傷，其中以腦部病變最為明顯。此外，秦振陽從湖南岳陽發生歪頭病的黑斑蛙腦部、眼球、肝臟、卵巢等多處組織器官分離到一株米爾伊麗莎白菌分離株HNW1681，可以引起蛙心臟、肝臟、腦、眼等不同程度的病理變化。這些研究表明米爾伊麗莎白菌對黑斑蛙的感染是呈全身性的，并且引起蛙全身性組織損傷。

3.3 黑斑蛙歪頭病的防控建議

本實驗藥敏試驗結果顯示，米爾伊麗莎白菌BSH3僅對米諾環素、氟苯尼考、利福平和萬古霉素四種藥物敏感。然而，利福平和萬古霉素這兩種藥在水產上是禁用藥，所以在黑斑蛙患歪頭病時應禁止使用。米諾環素和氟苯尼考是農業部批準使用的水產藥物，生產中可用鹽酸米諾環素粉劑100 g拌料1 000 kg，連用5～7 d或每kg體重拌飼投喂15～20 mg氟苯尼考粉，每天一次，連用3～5 d。但過度使用米諾環素易使水體污染和對水生生物產生毒性作用，因此生產中盡量不使用米諾環素治療黑斑蛙歪頭病。吳興鎮發現五味子、柯子、半枝蓮、五倍子，烏梅等植物性藥物在控制伊麗莎白菌感染時起到了良好的效果，加強植物性藥物的研發與使用可能是將來有效防治伊麗莎白菌病的重要途徑。此外，米爾伊麗莎白菌能夠侵害蛙的神經器官，比如大腦，可以在細胞間基質外生存，甚至少數細菌可以進入細胞質。在治療該病時，可以考慮使用一些更容易穿透血腦屏障的脂溶性藥物，如磺胺類藥物。周永燦等研究發現腦膜炎敗血伊麗莎白菌全菌疫苗能夠在一定程度上預防虎紋蛙白內障疾病的發生，這為利用免疫學方法防控伊麗莎白菌病提供了理論依據與數據支持。

在水產養殖過程中需要采用“以防為主，防治結合”的綜合防治方法?？股氐拈L期使用會導致細菌耐藥性的產生和水體環境的污染。應用疫苗開展疾病的免疫防治不僅可以提高動物自身的免疫水平、增強機體的抗病能力，而且還符合綠色環保的要求，將是水生動物疾病防治的主流發展方向。

4 結論

本研究通過形態學、生理生化特性分析與分子生物學相結合的方法，從患歪頭病黑斑蛙體內分離到致病菌株米爾伊麗莎白菌，名命為BSH3。病理組織觀察米爾伊麗莎白菌可以引起黑斑蛙全身性組織病理損傷。通過藥物敏感試驗，初步篩選出氟苯尼考可用于黑斑蛙歪頭病的防控。