31種中草藥及其復(fù)方對(duì)維氏氣單胞菌體外抑菌研究

張桓橋，商寶娣，張效平，周賢君，趙 鳳，李小義，孔 杰，楊 星，陶 莎

(1.貴州省水產(chǎn)研究所，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心，貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；4.貴陽(yáng)市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，貴陽(yáng) 550025)

維氏氣單胞菌()可感染包括大口黑鱸()、尼羅羅非魚(yú)()、斑點(diǎn)叉尾鮰()、日本沼蝦()在內(nèi)的多種經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物，所引發(fā)的病害在全球范圍頻繁暴發(fā)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成阻礙，有效防治維氏氣單胞菌的感染愈發(fā)重要。抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病主要防控手段，生產(chǎn)中抗生素的使用產(chǎn)生了一定的積極作用。然而，由于抗生素不能被機(jī)體完全吸收，大部分會(huì)以原形或代謝物形式進(jìn)入環(huán)境，導(dǎo)致抗生素在環(huán)境中廣泛賦存，且部分抗生素不易降解，可在水環(huán)境中持久存在并對(duì)非目標(biāo)物種產(chǎn)生負(fù)面影響。抗生素的持續(xù)使用與高的殘留所構(gòu)成的選擇壓力促使抗生素耐藥細(xì)菌(antibiotic resistant bacteria,ARB)和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的發(fā)生和傳播，不僅增加病害防控的成本，也對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。抗生素的不規(guī)范使用已造成負(fù)面且深遠(yuǎn)的影響，越來(lái)越多的病例報(bào)告表明，維氏氣單胞菌的耐藥性仍在不斷增強(qiáng)中。以抗生素作為水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌病害防控的主要手段已然不再完全適宜，開(kāi)發(fā)綠色安全的抗生素替代品迫在眉睫。

中草藥在預(yù)防和治療動(dòng)植物各種疾病方面有著重要價(jià)值，能以多機(jī)制、多靶點(diǎn)對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌以及其他病原生物產(chǎn)生抑制甚至殺滅作用，同時(shí)可有效增強(qiáng)宿主動(dòng)物的免疫力和抗病力，兼具治療性與保健性的作用。中草藥對(duì)耐藥菌有獨(dú)到的作用，能以消除耐藥質(zhì)粒、下調(diào)耐藥基因的表達(dá)、增加細(xì)胞膜通透性、阻礙細(xì)菌生物膜形成、抑制細(xì)菌主動(dòng)外排泵和β-內(nèi)酰胺酶等途徑逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性。中草藥來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，具有低殘留、無(wú)副作用、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，被視為抗生素的理想替代品，顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，但如何選擇有效抗菌中藥成為近年來(lái)研究的難點(diǎn)。

貴州省水產(chǎn)研究所水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與疾病防治實(shí)驗(yàn)室在魚(yú)類流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌是貴州畢節(jié)多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)流水養(yǎng)殖的昆明裂腹魚(yú)()潰瘍病的致病菌。為篩選對(duì)該菌有抑菌作用的中草藥及復(fù)方，本研究探究了31種中草藥對(duì)昆明裂腹魚(yú)源維氏氣單胞菌的抑菌作用，以棋盤交叉法測(cè)定抑菌活性較好的6種中草藥的聯(lián)用效果，并在此基礎(chǔ)上根據(jù)正交設(shè)計(jì)配伍中藥復(fù)方，以期對(duì)中草藥的運(yùn)用與減少生產(chǎn)中抗菌藥物的使用提供參考，為維氏氣單胞菌的預(yù)防和控制提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、MH液體培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；96孔板、牛津杯及其他試驗(yàn)耗材購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 中草藥液的制備

五倍子、黃連、地榆、訶子、蘇木、黃芩、艾葉、大黃、連翹、鹿銜草、山楂、烏梅、白頭翁、黃藥子、石榴皮、夏枯草、敗醬草、檳榔、陳皮、虎杖、黃柏、蒲公英、紫花地丁、穿心蓮、杜仲、紅花、射干、干姜、黃芪、小茴香、茯苓31種中草藥，均購(gòu)自本地中藥房。以煎煮法制備中草藥藥液，方法如下：20 g中草藥粉碎后于400 mL無(wú)菌蒸餾水中浸泡1 h，用大火煮沸后轉(zhuǎn)至文火熬制2 h，多層紗布過(guò)濾；殘?jiān)?00 mL水同法煎煮后過(guò)濾；合并兩次濾液，煎煮濃縮至20 mL，即藥液質(zhì)量濃度為1 000 mg/mL。待測(cè)中草藥液經(jīng)121 ℃、20 min滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 供試菌株

昆明裂腹魚(yú)源維氏氣單胞菌試驗(yàn)菌株由貴州省水產(chǎn)研究所水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與疾病防治實(shí)驗(yàn)室提供，編號(hào)為BL61C，2020年9月分離鑒定。無(wú)菌條件下，維氏氣單胞菌BL61C劃線接種于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單個(gè)菌落，接種于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，置于生物搖床中28 ℃、175 r/min培養(yǎng)18 h，用MH液體培養(yǎng)基以麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛日{(diào)整為1.0x10CFU/mL備用。

1.4 抑菌圈測(cè)定

采用牛津杯法測(cè)定抑菌圈大小。在一次性滅菌培養(yǎng)基中倒入一層滅菌MH培養(yǎng)基(約10 mL)，凝固后均勻放置4個(gè)滅菌牛津杯，再倒入MH培養(yǎng)基10～15 mL。每個(gè)平板上加200 μL備用菌液，用無(wú)菌棉棒涂抹均勻，去除牛津杯后將80 μL待測(cè)藥液加入孔中，28 ℃正置培養(yǎng)24 h。觀察結(jié)果并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.5 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

采用96孔板微量肉湯稀釋法測(cè)定待測(cè)中草藥對(duì)目的菌的MIC(圖1)。無(wú)菌條件下，取干凈96孔酶標(biāo)板(A～H列×12行)，各孔加入滅菌MH肉湯100 μL，第1行的A～D列中加入待測(cè)中草藥100 μL。充分混勻后，逐次倍比稀釋至第11行，最后一列稀釋完后吸取100 μL去掉，每孔液體終體積100 μL。1～11行藥液濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 mg/mL。A～C列的1～11行加入預(yù)備菌懸液10 μL，為試驗(yàn)組；第12孔不加入菌液，為陰性對(duì)照。D列的1～11行不加入菌液，作為空白對(duì)照查看是否生長(zhǎng)細(xì)菌；第12行加入10 μL菌液，為陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證細(xì)菌是否正常生長(zhǎng)；一板一藥，E～H列不做任何處理。28 ℃正置培養(yǎng)24 h后取出觀察結(jié)果，試驗(yàn)組與空白對(duì)照透明度相似的濃度即為待測(cè)中草藥的MIC。

圖1 96孔板微量肉湯稀釋法圖示

取高于MIC的濃度涂布于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)18 h。觀察結(jié)果，少于5個(gè)單菌落的濃度即為待測(cè)中草藥的MBC。

1.6 部分抑菌指數(shù)(FIC)測(cè)定

在1.4、1.5研究基礎(chǔ)，共篩選出6種抑菌作用明顯的中草藥，兩兩組合成15組二聯(lián)藥方(LY1～LY15)。采用棋盤交叉法測(cè)定聯(lián)用藥方的FIC。用滅菌MH營(yíng)養(yǎng)肉湯將待測(cè)中草藥液A與B分別稀釋至2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC濃度，配置完成的兩種單方中草藥據(jù)表1充分混合。各孔分別加入對(duì)應(yīng)濃度待測(cè)中草藥液A與B各50 μL、10 μL菌液、0.1%紅四氮唑(TTC)溶液4 μL，其中，TTC用于檢驗(yàn)細(xì)菌是否生長(zhǎng)。混合完成后，28 ℃正置培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，以FIC作為聯(lián)合抑菌效果判定依據(jù)。FIC值計(jì)算如下:

表1 棋盤交叉法

1.7 復(fù)方中草藥對(duì)致病菌的體外抑菌圈測(cè)定

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)方中草藥配置(表2)。以6種中草藥作為6種因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L(5^6)，分別為F1、F2、F3…F25，按比例進(jìn)行配制，每組的終體積為1 000 μL，體外抑菌試驗(yàn)參照前文1.4、1.5進(jìn)行。

表2 復(fù)方中草藥配制表

2 結(jié)果

2.1 單一中草藥抑菌效果

31種中草藥提取液對(duì)昆明裂腹魚(yú)源維氏氣單胞菌抑菌效果各不相同(表3)。其中，五倍子、訶子2種中草藥抑菌圈直徑分別為21.80 mm、23.20 mm，抑菌效果為極敏；地榆、蘇木、黃芩、黃連、艾葉、烏梅、石榴皮、夏枯草8種中草藥抑菌圈直徑介于15.00～20.00 mm之間，抑菌效果為高敏；鹿銜草、山楂、黃藥子、白頭翁4種中草藥抑菌圈直徑為10.00～15.00 mm，抑菌效果為中敏；其余17種中草藥抑菌效果不佳或無(wú)抑菌圈。MBC試驗(yàn)結(jié)果顯示，五倍子對(duì)昆明裂腹魚(yú)源維氏氣單胞菌抑殺作用最強(qiáng)，MIC和MBC分別為1.95、3.91 mg/mL；地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連5種中草藥抑殺作用明顯，MIC介于3.91～7.81 mg/mL，MBC介于7.81～15.63 mg/mL；艾葉、大黃、連翹、鹿銜草、山楂、烏梅6種中草藥抑殺作用較好，MIC均為15.63 mg/mL，MBC介于15.63～31.25 mg/mL；試驗(yàn)中，在藥物濃度<500 mg/mL時(shí)，除茯苓以外，其余30種中草藥均具一定抑菌作用。

表3 31種中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的體外抑菌效果

2.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及FIC結(jié)果

以五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連6種具良好抑菌作用的中草藥兩兩聯(lián)用進(jìn)行FIC試驗(yàn)，共15個(gè)組合(LY1～LY15)，見(jiàn)表4。結(jié)果表明，五倍子+地榆、訶子+黃芩聯(lián)用效果最好，F(xiàn)IC分別為0.31、0.50，表現(xiàn)為協(xié)同作用；五倍子+黃連、五倍子+訶子、黃連+訶子、黃連+黃芩、訶子+蘇木等5種組合聯(lián)用效果其次，F(xiàn)IC介于0.56～1.00之間，表現(xiàn)為相加作用；五倍子+蘇木、五倍子+黃芩、黃連+地榆等8種組合FIC介于1.06～2.00之間，表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用。聯(lián)用藥方(LY1～LY15)均未發(fā)生拮抗作用，僅黃芩+地榆、黃芩+蘇木聯(lián)用時(shí)FIC最大(2.00)，表明6種中草藥之間不存在藥性沖突，可進(jìn)行后續(xù)復(fù)方中草藥方配伍。

表4 藥物聯(lián)合的體外抑菌結(jié)果

2.3 復(fù)方中草藥對(duì)致病菌的體外抑菌結(jié)果

將五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連等6種單一中草藥按不同比例組合成25組復(fù)方(表2)，測(cè)定其對(duì)維氏氣單胞菌BL61C的體外抑菌作用(表5)。抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果表明，25組復(fù)方中草藥均具較好抑菌表現(xiàn)，抑菌圈直徑均大于15.00 mm，其中F7、F8、F11等11組復(fù)方抑菌圈直徑均大于20.00 mm，抑菌效果為極敏；其余14組復(fù)方抑菌圈直徑介于15.00～19.20 mm，抑菌效果為高敏。MIC與MBC試驗(yàn)結(jié)果表明，25組復(fù)方均具較強(qiáng)抑菌效果，MIC介于0.98～3.91 mg/mL，MBC介于1.95～7.81 mg/mL。綜合復(fù)方中草藥的抑菌作用來(lái)看，F(xiàn)16(五倍子：地榆：訶子：蘇木：黃芩：黃連=4∶4∶2∶5∶3∶1)的綜合抑菌效果最佳，抑菌圈直徑達(dá)23.20 mm，MIC與MBC分別為0.98 mg/mL、1.95 mg/mL，可作為維氏氣單胞菌BL61C殺菌藥物的首選配伍組合。

表5 復(fù)方中草藥的體外抑菌結(jié)果

3 討論

本研究中，抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果表明，有14種中草藥可對(duì)維氏氣單胞菌起抑菌作用，其中五倍子、訶子等中草藥體外抑菌效果最佳，抑菌圈直徑均大于20 mm，抑菌等級(jí)為極敏；MIC和MBC試驗(yàn)結(jié)果表明，在藥物濃度<500 mg/mL時(shí)，五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連的抑菌能力較強(qiáng)，MIC均小于7.81 mg/mL，MBC均小于15.63 mg/mL。Aggarwal等研究認(rèn)為，抗菌藥物的抑菌直徑與最小抑菌濃度呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈越大則MIC濃度越小。試驗(yàn)中多數(shù)中草藥的抑菌綜合表現(xiàn)符合這一結(jié)論，但部分中草藥抑菌直徑與MIC不成規(guī)律，如大黃的MIC為15.63 mg/mL，而抑菌圈直徑僅為9.00 mm；白頭翁的MIC為31.25 mg/mL，抑菌圈直徑僅為10.45 mm；連翹的MIC為15.63 mg/mL，但無(wú)抑菌圈，這可能與藥物在不同介質(zhì)中的擴(kuò)散能力與菌-藥有效接觸面積有關(guān)。本研究結(jié)果表明，抑菌圈測(cè)試對(duì)中草藥的抑菌能力的解釋可能稍顯不足，故在篩選中草藥時(shí)需綜合考量抑菌圈直徑、MIC與MBC等參數(shù)。綜合抑菌試驗(yàn)結(jié)果，五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連等中草藥，可作為昆明裂腹魚(yú)源維氏氣單胞菌防治的理想中草藥。

傳統(tǒng)中藥重視增效、減毒(相殺相畏配伍)，避免減效(相惡配伍/十八反)、增毒(相反配伍/十九畏)。查閱《神農(nóng)本草經(jīng)》，本研究選用的6種中草藥之間不存在配伍禁忌，可進(jìn)行相互之間的配伍組合。以具良好抑菌作用的五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連進(jìn)行FIC試驗(yàn)，聯(lián)用藥方(LY1～LY15)均未發(fā)生拮抗作用，6種待測(cè)中草藥之間不存在藥性沖突。張彬等研究認(rèn)為，黃芩與黃連聯(lián)用會(huì)發(fā)生拮抗作用，與本研究黃連與黃芩聯(lián)用后的相加表現(xiàn)不同，出現(xiàn)差異的原因可能與菌株來(lái)源及種類、藥物產(chǎn)地與炮制方法有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方中草藥的整體抑菌效果較單方更好。復(fù)方中草藥抑菌圈直徑均大于15.00 mm，抑菌等級(jí)為高敏或極敏；部分組方抑菌圈較五倍子、訶子單一作用時(shí)小，這可能與多種中草藥聯(lián)用時(shí)發(fā)生物理、化學(xué)反應(yīng)或作用位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致的抑菌活性成分損失或擴(kuò)散速率下降有關(guān)，也可能與單方中草藥的單位體積有效成分多于在組方中的含量，混合后抑菌成分含量減少存在聯(lián)系。復(fù)方中草藥MIC/MBC試驗(yàn)結(jié)果提示，合理的配伍可提高中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的體外抑菌作用，這對(duì)降低藥物成本、減少藥物使用及殘留具有重要作用。綜合整體抑菌結(jié)果，復(fù)方F16(五倍子∶地榆∶訶子∶蘇木∶黃芩∶黃連=4∶4∶2∶5∶3∶1)可作為維氏氣單胞菌BL61C抑菌藥物的首選配伍組合，但抑菌作用機(jī)制及組分協(xié)作方式亟待進(jìn)一步研究。本研究以簡(jiǎn)便的煎煮法制備31種中草藥水提取液并配制復(fù)方，初步研究它們對(duì)維氏氣單胞菌BL61C的抑菌性質(zhì)，然而，生產(chǎn)中中草藥常以浸泡后播撒、飼料添加劑或成品獸藥等多種形式使用，制備與使用方式的不同是否會(huì)對(duì)其抑菌能力產(chǎn)生顯著影響尚不清楚，故中草藥開(kāi)發(fā)為臨床獸藥還需結(jié)合中草藥的物質(zhì)特性及適宜制備工藝多加論證。