紅外光譜結合化學計量學快速檢測熊膽粉真偽及摻偽問題

袁明昊，周 濤，鐘文瀟，周 強，雷苛露，曾大富，李建剛，郭 力*

1成都中醫藥大學藥學院西南特色中藥資源國家重點實驗室；2成都晶博生物科技有限責任公司，成都 611137

熊膽粉為熊科動物黑熊SelenaretosthibetanusCuvies經膽囊手術引流膽汁而得的干燥品，具有清熱、平肝、明目的功效[1]，為我國四大名貴動物藥材之一。由于熊膽粉來源特殊價格昂貴，市場上存在以其他動物膽粉冒充熊膽粉進行銷售的情況。此外，本課題組前期市場調研發現由于豬膽粉和牛膽粉產量可觀價格低廉，外觀性狀與熊膽粉較為相似，除作為偽品冒充熊膽粉外，還常摻入熊膽粉中出售，且與偽品相比，摻偽品的檢測難度更高。此類現象導致市售熊膽粉質量參差不齊，嚴重影響臨床療效和消費者權益，因此，熊膽粉的真偽鑒別及摻偽比例預測對于熊膽粉的質量控制具有重要意義。

熊膽粉常用鑒別方法包括薄層色譜法[2]、高效液相色譜法[3]及特異性聚合酶鏈式反應(PCR)[4]，但此類方法存在耗時較長、操作復雜、對樣本有破壞性等問題，且在樣本量較大的情況下部分方法耗費大量有機試劑。近紅外光譜具有分析速度快、對樣本破壞性小、無需預處理等優點，現已廣泛應用于中藥的真偽和摻偽鑒別[5]。然而由于熊膽粉具有強烈的吸濕性，用于近紅外光譜分析后易損失部分樣品，因此該方法應用于膽類藥材具有一定的局限性。與近紅外光譜相比，紅外光譜法同樣具有分析快速、靈敏等特點，且所需樣本量極少，更適用于貴重藥材的質量控制。目前采用紅外光譜法鑒別熊膽粉的報道較少，僅Yan等[6]對比了熊膽粉與其余3種動物膽粉的紅外光譜，但其樣本量較少，對摻偽行為缺乏關注且未結合化學計量學對結果可視化。本研究以熊膽粉與豬膽粉、牛膽粉制備了不同比例的摻偽樣品，采集了正品、7類偽品及2類摻偽品的紅外光譜，采用基線校正、平滑、求導等預處理方法對所得光譜進行優化，結合正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)和偏最小二乘回歸(PLSR)方法，探究紅外光譜用于熊膽粉真偽鑒別及摻偽比例預測的可行性，為熊膽粉及其他貴重藥材的質量控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

傅里葉變換紅外光譜(PerkinElmer)；YP-2壓片機(上海山岳科學儀器有限公司)。

1.2 樣品與試劑

1.2.1 正品熊膽粉

供試熊膽粉共94批，由成都晶博生物科技有限公司提供，經成都中醫藥大學龍飛副教授鑒定為中藥熊膽粉正品。樣品研碎過80目篩后置干燥器中保存備用。

1.2.2 偽品及摻偽品

豬膽粉、牛膽粉、羊膽粉、兔膽粉、雞膽粉、鴨膽粉和鵝膽粉各10批由實驗室自制，新鮮膽汁過濾后50 ℃鼓風干燥，研碎過80目篩即得。將豬膽粉和牛膽粉分別按照不同的比例(W/W)摻入10批正品熊膽粉中，共得180批摻偽熊膽粉(豬膽粉摻偽、牛膽粉摻偽各90批)，其中豬膽粉摻偽比例為7.92%～91.84%，牛膽粉摻偽比例為8.08%～94.24%。

1.2.3 試劑

光譜級溴化鉀購于成都市科隆化學品有限公司。

1.3 壓片及樣品測定

取供試品粉末約1.0 mg，加入150 mg溴化鉀粉末，置瑪瑙研缽中研細并混合均勻，隨后置壓片模具中于壓片機上壓片2 min，取出置透射測定架并采集其紅外光譜。

以空白溴化鉀為背景，光譜采集范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數為32次。

1.4 光譜預處理

采用OMNIC 9.2軟件對光譜數據進行自動基線校正、平滑、標準正態變量變換(SNV)及求導后導出數據為CSV格式，采用Origin 2021軟件繪制紅外圖譜，使用SIMCA 14.1軟件建立OPLS-DA模型，使用The Unscrambler X 10.4軟件建立PLSR模型。

1.5 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

OPLS-DA是在偏最小二乘判別(PLS-DA)基礎上發展的一類有監督的學習方法，與PLS-DA相比，OPLS-DA將X變量中的系統變異分解為同Y變量線性相關和同Y變量正交的部分，隨著正交變異組分增加將提供更多的解釋性[7]。OPLS-DA模型的優劣通過內部驗證、置換驗證及外部驗證進行評價。一般情況下，內部驗證中模型對變量解釋度R2和預測度Q2越接近1，且R2和Q2差距不大于0.2～0.3，則模型越可靠。置換驗證中所有樣品對應R2和Q2計算值所組成的擬合直線在Y坐標軸的截距應分別小于0.3和0.05。外部驗證中預測準確率越高則模型越可靠[8]。

1.6 偏最小二乘回歸(PLSR)

2 結果與分析

2.1 紅外光譜分析

8種動物膽粉的紅外光譜圖經自動基線校正及平滑預處理后如圖1所示，熊膽粉的主要吸收峰位于3 430、2 925、2 860、1 650、1 550、1 200、1 050 cm-1等處，其中3 430 cm-1處寬峰為-OH和-NH基團的伸縮振動；2 925和2 860 cm-1處為烷烴C-H的伸縮振動；1 650和1 550 cm-1處分別為-CO伸縮振動以及N-H的彎曲振動，二者為酰胺基特征吸收峰；1 200和1 050 cm-1處的雙強峰為-SO3H的特征吸收峰[13]。大部分偽品吸收峰波段與熊膽粉較為相似但吸收強度不同，其中磺酸基的吸收峰強度差異最為顯著。此外，僅牛膽粉和羊膽粉紅外光譜圖中1 000～900 cm-1波段表現出膽酸吸收峰[14]。動物膽粉中主要化學成分為膽汁酸且以結合型膽汁酸為主，紅外光譜反映了此類化合物酰胺基和磺酸基等多種化學鍵信息，為利用紅外光譜鑒別熊膽粉真偽及預測摻偽比例提供了理論依據。

圖1 熊膽粉及其偽品紅外圖譜

2.2 熊膽粉正品、偽品及摻偽品的鑒別分析

2.2.1 樣本集劃分

采用SPSS 25將正品、偽品及摻偽品按4∶1比例進行隨機樣本集劃分，其中正品、偽品及摻偽品校正集樣本分別為75、56和144份，驗證集樣本分別為19、14和36份。累計獲得校正集275份，驗證集69份。

2.2.2 預處理方法選擇

在紅外光譜采集過程中，樣品制備過程及外界環境均會對光譜數據產生一定的影響，因此，在建立紅外模型之前需對紅外光譜進行預處理。本課題組前期研究發現樣本的紅外光譜基線漂移嚴重，在不對其進行基線校正的情況下觀察到明顯的組內差異，后續無論何種預處理方法均無法改善此類情況。因此，所有原始光譜均經自動基線校正(Baseline)及平滑(SG-Smoothing)之后進行后續預處理。紅外光譜常用的預處理方法包括標準正態變量變換(SNV)、一階求導(1st D)和二階求導(2nd D)等。SNV可消除樣本顆粒分布不均勻對光譜的散射影響，而求導可提高光譜分辨率和靈敏度[15]。不同光譜預處理方法建立的熊膽粉正品、偽品及摻偽品的OPLS-DA模型參數見表1。結果表明，經SNV + 2nd D預處理后模型性能最佳，校正集和驗證集預測準確率均高于95%。該模型最佳主成分個數為2，累計解釋了86.26%的總方差。

表1 不同光譜預處理方法建立的熊膽粉-摻偽品-偽品樣本判別模型性能

2.2.3 熊膽粉正品、偽品及摻偽品判別分析模型的建立與驗證

如圖2所示，熊膽粉正品、偽品和摻偽品具有各自的空間分布，由于偽品中包含多種其他動物膽粉，因此該分組中部分樣本分布較為離散。校正集中僅有1個豬膽粉樣本被誤判為摻偽品，驗證集中有一個熊膽粉正品樣本和牛膽粉樣本被誤判為摻偽品。對模型進行置換驗證結果模型中所有樣品對應R2和Q2計算值所組成的擬合直線在Y坐標軸的截距分別為0.162和-0.267，表明該模型沒有過擬合。

圖2 正品、偽品和摻偽品得分圖

為驗證模型的預測能力，使用模型外的5批熊膽粉、10批摻偽熊膽粉(不同比例摻偽豬膽粉及牛膽粉各5批)和25批偽品(豬膽粉和牛膽粉各5批，其余動物膽粉各3批)進行外部驗證。將以上外部驗證樣本代入已建立的OPLS-DA模型，模型判別準確率為100%，表明該模型具有良好的預測能力，可用于鑒別熊膽粉真偽及摻偽行為。

2.2.4 偽品來源判別模型的建立與驗證

同“2.2.1”項下樣本集劃分方法，所有偽品膽粉紅外光譜經預處理后建立了OPLS-DA模型用以區分偽品膽粉來源，最佳預處理方法為SNV + 2nd D。該模型最佳主成分個數為6，R2= 0.970，Q2= 0.957，校正集和驗證集預測準確率均為100%，基于前2個主成分的2D得分圖如圖3所示。置換驗證中中所有樣品對應R2和Q2計算值所組成的擬合直線在Y坐標軸的截距分別為0.136和-0.384，證明該模型沒有過擬合。所有外驗證樣本均被正確判別，表明該方法可在區分熊膽粉真偽的基礎上進一步鑒別偽品來源。

圖3 不同偽品得分圖

2.2.5 不同類別摻偽熊膽粉判別模型的建立及驗證

同“2.2.1”項下樣本集劃分方法，將所有摻偽熊膽粉樣本劃分為訓練集與驗證集。摻偽品類別鑒定的OPLS-DA模型最佳光譜預處理方法為SNV + 1st D，該模型最佳主成分個數為8，R2= 0.923，Q2= 0.868，校正集和預測集準確率分別為100%和97.22%，其2D得分圖如圖4所示。置換驗證中中所有樣品對應R2和Q2計算值所組成的擬合直線在Y坐標軸的截距分別為0.205和-0.410，表明該模型沒有過擬合。將10批未參與建模的摻偽熊膽粉樣本代入模型進行外部驗證，結果準確率為100%。上述結果表明，紅外光譜結合化學計量學可鑒別熊膽粉正品、偽品及摻偽品并可進一步區分摻偽品類別。

圖4 不同類型摻偽品的得分圖

2.3 熊膽粉摻偽比例定量分析

2.3.1 樣本集劃分

同“2.2.1”項下樣本集劃分方法，將2種摻偽熊膽粉樣本分別進行樣本集劃分，各自得到72個校正集和18個驗證集樣本。

2.3.2 預處理方法選擇

表2 不同光譜預處理對不同類別摻偽熊膽粉的定量分析模型校正和預測結果的影響

2.3.3 最佳因子數的選擇

圖5 PLSR模型中不同因子數的預測殘差平方和與驗證集R2

2.3.4 摻偽熊膽粉定量校正模型的建立與評價

圖6 熊膽粉摻偽比例模型的預測值與實際值

2.3.5 定量校正模型的外部驗證

選擇未參與建模的5批豬膽粉和牛膽粉樣品與熊膽粉按不同比例混合，將采集的紅外光譜輸入已建立的PLSR模型進行外部驗證。預測回收率為外部驗證樣本的模型預測值與實際值之比，結果見表3。熊膽粉摻偽豬膽粉的模型預測值和真實值相對誤差為2.64%～9.61%，平均回收率為104.81%；熊膽粉摻偽牛膽粉的模型預測值和真實值相對誤差為2.51%～8.87%，平均回收率為100.11%。以2種摻偽樣本的模型預測值與真實值分別進行配對t檢驗，結果P值均大于0.05，表明模型預測值與實際值無顯著性差異，通過紅外光譜結合PLSR可實現對以上兩種摻偽物摻偽比例的快速預測。

表3 外部驗證樣本預測結果

3 討論與結論

與目前動物膽類藥材常規分析方法相比，紅外光譜法在保證結果準確性的同時節省了時間與成本，以近乎無損的方式完成了對貴重藥材的質量控制。根據目前本課題組收集樣本所建立的熊膽粉定性及定量模型，紅外光譜法展現出了優異的檢測能力，但光譜模型建立在大量樣本的基礎上且需不斷補充樣本以提高模型準確性及穩定性，因此后續將進一步增加樣本類別及數目，更為準確地評價熊膽粉質量。

隨著化學計量學的發展，紅外光譜在藥材質量控制方面具有廣泛的應用前景，本研究為貴重藥材質量控制提供了一個簡單快捷的新方法，也為熊膽粉的質量控制提供了參考依據。