馬兜鈴酸I致急性腎損傷的分子機制研究

王 帆，王 靜，黃 愷，彭 淵，劉成海,，陶艷艷*

1上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所；2上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203

馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)天然存在于馬兜鈴科植物中，具有抗腫瘤、抗感染、抗炎等功效，含AA的中藥及成藥制劑廣泛應用于臨床[1]，包括馬兜鈴屬木香、防己、朱砂蓮、細辛屬的細辛、山慈菇等中藥以及復方胃痛膠囊、喘息靈膠囊、十三味疏肝膠囊等中成藥[2]。研究也表明，AA暴露與腎病和上尿路癌的發生存在高風險相關[3]；作為AA的主要成分之一，馬兜鈴酸I(aristolochic acid I，AAⅠ)同樣具有腎毒性與致癌性[4]；長期服用含此類物質的中藥可引起馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)[5]。目前已有不少關于AAI腎毒性的研究，但全面表征其毒理機制的報道并不多[6]，大多為針對某一細胞或者信號通路的研究。因此仍需要進一步探索AAI毒性機制。轉錄組是細胞內所有基因轉錄產物的總和[7]，轉錄組學是對轉錄組的研究，涵蓋了與RNA相關的內容，如轉錄、表達、功能等。為了更全面了解AAI腎毒性機制，本研究采用IIIumina高通量測序平臺對腎組織進行轉錄組學測序，進行差異表達及GO、KEGG富集分析，以明確AAI致腎毒性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物

AAI(純度>98.5%，批號：3503)，購自上海詩丹德標準技術服務有限公司，4 ℃冰箱存放備用；羧甲基纖維素鈉(批號：F20051103)，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠15只，體質量23～25 g，6～8周齡，SPF級，購于上海南方模式生物科技股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0010。于上海南方模式生物科技股份有限公司SPF級環境飼養，動物使用許可證號：SYXK(滬)2019-0003。所有操作均由上海南方模式生物科技股份有限公司實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批通過(審批號：IACUC號2018-0026)。

1.1.3 試劑

血肌酐(serum creatinine，Scr)試劑盒(批號：20150526)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)試劑盒(批號：20150511)均購自南京建成生物工程研究所；Trizol Reagent(批號：F919KB3054)、總RNA提取試劑盒(批號：B518811)均購自上海生工生物工程股份有限公司；反轉錄試劑盒(批號：AJ92014A，日本TAKARA公司)；擴增試劑盒(批號：AJF0343A，日本TAKARA公司)。

1.1.4 主要儀器

實時熒光定量PCR儀(美國Life Technonogy公司)；熒光倒置顯微鏡(Olympus IX70，日本)。

1.2 方法

1.2.1 AAI溶液配置

100 mg羧甲基纖維素鈉溶解于20 mL雙蒸水中配置成0.5%的混懸液。40 mg AAI加入20 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液中制備成2 mg/mL貯存液，超聲震蕩直至完全溶解，4 ℃保存備用。

1.2.2 動物分組及模型建立

小鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組(N，n=6)和模型組(M，n=9)。模型組小鼠以AAI 20 mg/kg劑量連續腹腔注射，每天1次，連續5天，正常組小鼠注射相同容積的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液。

1.2.3 樣本采集

造模第6日，小鼠用3%戊巴比妥鈉進行麻醉，打開腹腔取下腔靜脈血，置于-80 ℃冰箱保存，用于測定Scr、BUN。摘除腎臟，一側腎臟組織沿矢狀面剖開，取二分之一用4%甲醛固定，用于HE染色；另取100 mg腎組織存于Trizol中用于提取RNA。

1.2.4 血清檢測及HE染色

按試劑盒說明書進行Scr、BUN水平的檢測。腎組織經4%中性甲醛緩沖液固定，自動脫水機脫水，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學顯微鏡觀察并拍照。腎組織病理改變參照文獻[8]以評估腎小管和腎間質病變程度。

1.2.5 腎組織RNA提取及轉錄組測序

Trizol提取腎組織總RNA，Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)進行質量檢測；使用Qubit 2.0 RNA檢測試劑盒測定RNA濃度，包括mRNA分離/片段化、雙鏈DNA合成、末端修復、末端dA-Tailing、橋頭連接、連接產物純化、片段大小分選以及文庫擴增等；精確定量后回收的DNA，按1∶1比例定量混合，IIIumina HiSeq X Ten測序儀用于測序，產生150 bp的雙端數據。建庫測序及數據分析部分由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.2.6 質量控制及參考基因組比對

使用Trimmomatic(version 0.36)軟件進行質控并去除接頭，在此基礎上過濾掉低質量堿基以及N堿基，最終得到高質量的Clean reads。hisat2(v2.2.1.0)軟件用于將得到的Clean Reads與小鼠參考基因組(從NCBI中下載參考基因組，基因組版本為GRCm38.p6)進行序列比對，以獲取在參考基因組或基因上的位置信息和測序樣品特有的序列信息。各樣本的有效數據量分布在5.99～6.83 G，Q30堿基分布在93.97%～95.01%，平均GC含量為47.90%。通過將reads比對到參考基因組上，得到各個樣本的基因組比對情況，比對率為92.6%～98.23%。

1.2.7 差異表達基因篩選

導出各樣本測序結果，并運用R語言中的“Affy”“limma”軟件包分析差異表達基因。Affy包去除原始數據中系統誤差，從而得到標準化的基因表達數據；Limma包用于對正常組織和腎損傷組織標準化之后的數據進行差異表達分析。篩選條件為P<0.01且差異倍數(fold change，FC)≥2.0，獲取上調和下調的差異基因。使用Pheatmap包繪制熱圖和火山圖。

1.2.8 差異表達基因的GO和KEGG富集分析

得到差異表達基因后，采用“clusterProfiler”“colorspace”“enrichplot”“ggplot2”“org.Mm.eg.db”“stringi”R語言包對差異表達基因進行GO和KEGG富集分析，篩選條件為P.value cutoff<0.05和Q.value cutoff<0.05。計算生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)以及分子功能(molecular function，MF)的基因富集數，最后將排名前20的GO生物過程和KEGG通路繪制為氣泡圖。

1.2.9 差異表達基因的qRT-PCR驗證

基于轉錄組結果，選擇兩組間FC最為明顯的前5個基因(見圖3)進行qRT-PCR驗證。使用NCBI在線引物設計軟件Primer-Blast設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成(基因名稱、引物序列見表1)。Trizol提取腎組織總RNA，采用試劑盒進行逆轉錄，按照SYBR Premix Ex Taq II熒光染料法實時定量試劑盒說明進行cDNA擴增，每個樣品重復3次。以β-actin為內參，采用2-△△CT法進行分析定量。

表1 熒光定量PCR各基因引物序列

1.2.10 統計學方法

2 結果

2.1 AAI處理小鼠腎損傷的血清生化和腎組織病理變化

分別對正常組、模型組小鼠進行血清生化檢測與腎組織HE染色。結果發現，與正常組相比，模型組小鼠Scr增高約12倍、BUN增高約3倍(見圖1A、圖1B)。HE染色顯示，正常腎組織結構正常，腎小球、腎小管、腎間質均未見到明顯改變；模型組腎小球水腫、腎小球固縮，近曲小管上皮細胞脫落(見圖2)。

圖1 正常組與模型組小鼠血清生化變化

圖2 正常組與模型組小鼠腎組織病理變化(×100，標尺=100 μm)

2.2 AAI處理小鼠腎損傷差異表達基因篩選及GO富集分析

對AAI處理小鼠表達差異基因進行篩選與GO富集分析(見圖3)。發現達到篩選標準的基因(FC≥2.0且P值<0.01)共有4 975個，其中上調基因有2 511個，下調基因有2 464個。熱圖(見圖3A)顯示出多個基因在兩個組別中的表達水平。與正常組相比，模型組主要有以下基因發生差異性表達：Kap、Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc等。火山圖(見圖3B)用于展示基因表達差異的分布，其中橫軸為差異倍數的對數，越偏離中心差異倍數越大；縱軸為多差異顯著性P值的負對數，值越大表明差異越顯著，紅點代表顯著上調的基因，綠點代表顯著下調的基因。

圖3 AAI作用下正常組與模型組小鼠差異表達基因

2.3 AAI處理小鼠腎損傷差異表達基因的生物功能分析

為進一步了解差異表達基因的功能及其在分子水平上的作用，并針對差異表達基因進行GO注釋(見圖4)。Gene Ratio表明差異基因中與該Term相關的基因數與差異基因總數的比值，圓圈大小代表基因的多少，Qvalue為對P值進行統計學檢驗的Q值，Qvalue值越小說明富集程度越明顯。

圖4 AAI作用下差異表達基因的GO注釋

GO-BP分析顯示涉及的生物學過程主要有：小分子分解代謝過程；中性粒細胞參與的免疫應答；胞外間質組織；脂肪酸代謝過程；有機酸分解代謝過程；羧酸分解代謝過程；對有毒物質的反應；免疫應答；對金屬離子的反應；血小板脫粒等。

GO-CC分析結果提示涉及的細胞組分主要有：顆粒腔；細胞質囊泡腔；質膜的外側；含膠原的細胞外基質；血液微粒；血小板α顆粒；過氧化物酶基質；微體腔等。

GO-MF分析結果提示涉及的分子功能主要有：硫化合物的結合；酰胺結合；氧化還原酶活性；抗氧化活性；氨肽酶活性；過氧化物酶活性；胱甘肽過氧化物酶活性等。

2.4 馬兜鈴酸I處理小鼠腎損傷差異表達基因的KEGG分析

對AAI作用下表達的差異基因進行KEGG富集分析(見圖5)，其中富集因子(enrichment score，ES)代表基因的富集程度，P-value值越接近0表示富集程度越顯著。結果發現與AAI處理后腎損傷相關的通路包括JAK-STAT、NF-κB、PPAR信號通路；補體系統激活和凝血級聯反應；過氧化反應；糖酵解/糖異生、胰島素抵抗；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解；類固醇激素合成等途徑。

圖5 AAI作用下差異表達基因KEGG富集分析

2.5 差異表達基因的qRT-PCR驗證

在表達的差異基因中挑選5個差異基因，以β-actin為內參，運用qRT-PCR以驗證RNA-seq的可靠性(見圖6)。結果發現，與正常組相比，模型組Kap基因表達量明顯減少；Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc基因表達量顯著增加，與轉錄組結果一致，驗證了轉錄組結果的可靠性。

3 討論與結論

AA的毒性作用早在20世紀90年代已被報道，隨后被世界衛生組織國際癌癥研究機構列為一級致癌物[9]。目前我國已禁止諸如廣防己、關木通等AA含量較高藥材的使用，而相對含量較低的馬兜鈴科植物及其制劑仍應用于臨床治療[10]。AAI是AA的主要成分，不同中藥材中AAI含量亦不同，如細辛類藥材中AAI含量在10 μg/g左右[11]，朱砂蓮中AAI的含量介于0.938 6～3.567 5 mg/g之間[12]。朱砂蓮臨床給藥5～10 g時AAI量達到9.386～35.675 mg之間。本文參考他人研究[13,14]，小鼠以AAI 20mg/kg劑量給藥5天，即出現明顯腎損傷：血肌酐、尿素氮均明顯升高；腎小球水腫、腎小球固縮，近曲小管上皮細胞脫落。

RNA-seq是以高通量測序技術為基礎，對組織細胞中的所有mRNA進行高通量測序分析的技術。本研究利用轉錄組學對AAI處理的小鼠腎組織RNA進行轉錄組學分析，發現與正常組差異表達基因共4 975個，其中上調的基因有2 511個，下調的基因有2 464個，其中差異表達基因中前5位為kap、Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc。

Kap為腎臟雄激素調節蛋白，是腎臟近端腎小管細胞中一種具有高度特異性，并且受到嚴格調節的蛋白，研究表明Kap與親環蛋白B相互作用可以保護近端小管細胞免受環孢霉素A毒性的影響[15]。Spp1也被稱為骨橋蛋白，是一種細胞外基質趨化因子樣磷酸糖蛋白，與免疫調節，腫瘤發生和細胞信號傳導相關[16]，有研究發現Spp1的上調可激活NF-κB信號通路促進癌癥進展[17]。Aldh1a2屬于醛脫氫酶1家族，參與腎臟發育過程中內源性全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)的合成[18]。作為一種維生素A的活性代謝產物，ATRA在細胞增殖，分化以及凋亡中均起著重要作用[19]。Serpine1為1型纖溶酶原激活物抑制劑，許多研究指出其在癌癥中存在異常表達，如口腔鱗狀細胞癌，食道癌，膀胱癌等[20]。Tnc是一種大分子細胞外基質(ECM)糖蛋白，在胚胎發育過程中高度表達[21]。它能夠與ECM結構蛋白和細胞表面受體(如EGFR、整聯蛋白)結合，激活下游途徑，從而調節細胞的粘附，擴散，遷移和增殖，研究顯示Tnc是促進成纖維細胞增殖的主要成分，在腎纖維化中起著關鍵作用[22]。但在急性腎損傷期，Tnc亦可被誘導，進而增強Wnt/β-catenin信號傳導，以起到保護腎臟的作用[23]。上述基因與AAI腎毒性相關報道不多。

AAI腎毒性差異表達的基因主要在小分子代謝過程、胞外間質組織以及中性粒細胞參與的免疫應答等GO分類中顯著富集。KEGG分析表明差異表達基因在JAK-STAT、NF-κB信號通路；過氧化反應；糖酵解/糖異生；胰島素抵抗；纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解等途徑中富集明顯。由此提示AAI導致的腎毒性可能與炎癥反應、氧化應激、糖代謝等途徑相關。

鑒于AAI對腎臟具有明顯的毒副作用，臨床上在使用青木香、朱砂蓮、尋骨風[24]等含馬兜鈴酸中藥的過程中應注意監測腎功能；同時，轉錄組學揭示的AAI腎毒性的基因及相關信號通路，可能為AAI腎毒性提供一定的治療思路。