冬季兩種舍飼模式對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能的影響

郭文亮 郭燕菲 吳瑋琪 郭世偉 石璐璐 金 曉 史彬林

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

溫度是影響動(dòng)物健康和生存的重要環(huán)境因素。冬季冷暴露是北方畜牧養(yǎng)殖中非常普遍的問(wèn)題。冷暴露會(huì)降低動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和飼料轉(zhuǎn)化效率，并增加維持的能量消耗[1-2]。急性冷暴露可提高機(jī)體適應(yīng)能力，但長(zhǎng)期慢性冷暴露會(huì)使機(jī)體處于冷應(yīng)激狀態(tài)，干擾代謝和生理平衡，增加機(jī)體活性氧(ROS)的產(chǎn)生，引起氧化失衡[3-6]，并降低免疫細(xì)胞因子水平和免疫球蛋白分泌，造成動(dòng)物的免疫功能下降[7-9]。長(zhǎng)期冷暴露還會(huì)引起熱休克蛋白(HSP)水平提高，HSP是體內(nèi)重要的分子伴侶蛋白，可通過(guò)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)保護(hù)機(jī)體，緩解炎癥反應(yīng)和氧化失衡狀態(tài)，其水平的高低通常是衡量應(yīng)激大小的重要指標(biāo)[10-12]。

內(nèi)蒙古地區(qū)冬季嚴(yán)寒，平均夜間溫度約為-28 ℃。在冬季為綿羊提供羊舍抵御降雪和冷風(fēng)等惡劣環(huán)境條件，可以緩解低溫應(yīng)激，提高動(dòng)物福利[13]。Scholtz等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在冬季和春季將母羊放在溫暖的棚舍里可以提高羔羊的出生率、初生重和成活率[14]。也有研究者指出，綿羊適應(yīng)性較強(qiáng)，在冬季飼養(yǎng)時(shí)需提供運(yùn)動(dòng)場(chǎng)保證綿羊充足的戶(hù)外活動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)量來(lái)滿(mǎn)足生長(zhǎng)發(fā)育需求[15]，北方的集約化牧場(chǎng)在冬季大多使用半開(kāi)放式畜舍來(lái)保證舍內(nèi)通風(fēng)與溫度[16]，在高寒地區(qū)的冬季，多數(shù)牧民只使用舍外放牧即可滿(mǎn)足綿羊生長(zhǎng)需求[17]。且有研究發(fā)現(xiàn)，適宜的冷刺激不僅不會(huì)降低生產(chǎn)性能，還會(huì)提高機(jī)體免疫球蛋白的水平和抗急性冷應(yīng)激的能力[18]。因此，北方牧民和養(yǎng)殖場(chǎng)主要采用兩種羔羊舍飼方式：一種是將羔羊飼養(yǎng)在封閉式羊舍內(nèi)，不設(shè)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)(封閉式舍飼方式)，可保持舍內(nèi)溫度；另一種是將羔羊飼養(yǎng)在設(shè)有舍外運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的封閉式羊舍內(nèi)，舍門(mén)敞開(kāi)供羔羊自由出入(開(kāi)放式舍飼方式)，可保證其運(yùn)動(dòng)量與舍內(nèi)通風(fēng)量。這兩種飼養(yǎng)方式均為羔羊提供了抵御惡劣環(huán)境條件的羊舍，但哪一種飼養(yǎng)方式更有利于羔羊的健康與生長(zhǎng)，目前尚未見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道。

本研究即以杜蒙雜交母羔羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，分析比較上述兩種舍飼方式對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能、血液熱休克蛋白、免疫和抗氧化功能的影響，為北方地區(qū)寒冷天氣條件下綿羊羔羊的科學(xué)舍飼管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究于2019年12月20日—2020年1月17日期間在內(nèi)蒙古呼和浩特市土默特左旗境內(nèi)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。選取30只健康的2月齡、體重相近((16.42±2.52) kg)的杜泊×蒙古羊雜交母羔羊，隨機(jī)分為2個(gè)處理組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3只羊，2個(gè)處理組如下：(1)封閉式舍飼組(Closed house feeding group, CHG)，羔羊圈養(yǎng)在有窗羊舍內(nèi)(羊舍面積4 m×5 m)，不設(shè)舍外運(yùn)動(dòng)場(chǎng)；(2)開(kāi)放式舍飼組(Opened house feeding group, OHG)，羔羊飼養(yǎng)在設(shè)有舍外運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的有窗封閉式羊舍內(nèi)(羊舍面積4 m×5 m，運(yùn)動(dòng)場(chǎng)面積4 m×5 m)，舍門(mén)全天敞開(kāi)供羔羊自由出入。試驗(yàn)期28 d，每天分兩次(在08:00和16:00)給試驗(yàn)羔羊定量上料，每日早晨稱(chēng)取剩料重，并記錄剩料量，全期自由飲水。于試驗(yàn)第1天(IWB)和第28天(FWB)給試驗(yàn)羊稱(chēng)重，計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F∶G)。試驗(yàn)羊飼料配方根據(jù)(NRC2007)制定，如表1所示。

表1 試驗(yàn)羔羊的飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental lambs (Air-dried basis)

1.2 環(huán)境指標(biāo)的測(cè)定

每天在08:00、14:00和20:00分別使用小葉片風(fēng)速儀(testo 416小葉輪風(fēng)速計(jì)，Testo SE&Co. KGaA，美國(guó)西切斯特)記錄3次兩組舍內(nèi)和舍外的風(fēng)速。于羊舍中部和羊舍外距地面1 m高處(畜體高度)懸掛日記型自記式溫濕度記錄儀(ZJI-2A型，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)，分別監(jiān)測(cè)并計(jì)算試驗(yàn)期內(nèi)兩組舍內(nèi)及舍外平均空氣溫度和相對(duì)濕度。每周分別在08:00、14:00和20:00時(shí)間點(diǎn)采集3次兩組舍內(nèi)及舍外氣體，使用100 mL注射器采用五點(diǎn)法于舍內(nèi)畜體高度吸取100 mL氣體勻速通過(guò)氨氣和二氧化碳?xì)怏w檢測(cè)管(氣體檢測(cè)管，北京北科綠洲安全環(huán)境科技有限公司)，靜置1 min后準(zhǔn)確讀數(shù)并記錄兩組舍內(nèi)和舍外的氨氣與二氧化碳含量，具體操作參照牛壯等[19]方法。

1.3 樣品采集

在試驗(yàn)期第7、14、21和28天的06:00使用非抗凝真空采血管和含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝采血管在空腹?fàn)顟B(tài)下對(duì)試驗(yàn)羊隨機(jī)選取10只進(jìn)行頸靜脈采血。靜置約30 min后將血樣以3 000 g離心20 min后分別收集血清和白細(xì)胞[7]，血清-20 ℃ 保存，待血清免疫抗氧化指標(biāo)測(cè)定。白細(xì)胞中加入1 mL Trizol，混勻后靜置3～5 min，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，進(jìn)行后續(xù)提取RNA，待免疫抗氧化相關(guān)基因表達(dá)分析。

1.4 血清熱休克蛋白、免疫及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

血清胰島素(INS)、熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白90(HSP90)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)使用綿羊特異性ELISA試劑盒(中國(guó)泉州瑞星生物科技有限公司)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。血清中總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量采用試劑盒比色法測(cè)定(南京建成生物工程研究所)。

1.5 總RNA提取和定量RT-PCR分析

使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國(guó))提取血液中白細(xì)胞中的總RNA，根據(jù)石璐璐[7]方法定量分離出總RNA。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用PrimeScript RT試劑盒將RNA去除后，再用基因組DNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(Takara Bio Inc.，Otsu，Japan)。使用qPCR TB Green Kit和Light Cycler 96進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。qRT-PCR使用10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行，程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，退火30 s，40個(gè)循環(huán)。表2列出了不同基因的最佳退火溫度，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。將β-肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表2 本研究的引物序列信息Table 2 Primer Sequences information in this study

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用Excel 2016 整理后，通過(guò)SAS 9.2軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。P<0.01時(shí)表示差異極顯著，P<0.05時(shí)表示差異顯著，P>0.05時(shí)差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩組舍內(nèi)及舍外空氣環(huán)境參數(shù)測(cè)定

試驗(yàn)期兩組舍內(nèi)及舍外的溫度、相對(duì)濕度、風(fēng)速和氨氣與二氧化碳含量如表3所示。CHG舍內(nèi)溫度、相對(duì)濕度、氨氣和二氧化碳分別較舍外高9.5 ℃、13.92%、2.36 mg/m3和98.39 mg/m3。OHG舍內(nèi)溫度、相對(duì)濕度、氨氣和二氧化碳分別較舍外高4.05 ℃、3.84%、0.70 mg/m3和38.62 mg/m3。CHG和OHG舍內(nèi)均處于無(wú)風(fēng)狀態(tài)，風(fēng)速分別為0.06 m/s 和0.07 m/s。

表3 兩組舍飼方式舍內(nèi)外全天平均溫度、相對(duì)濕度、風(fēng)速和氨氣與二氧化碳含量Table 3 All-day mean values of two group indoor and outdoor temperature,relative humidity, wind speed, NH3 and CO2 content

2.2 舍飼方式對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能的影響

如表4所示，CHG羔羊的末體重高于OHG，但差異不顯著(P>0.05)，OHG羔羊的平均日增重顯著低于CHG(P<0.05)，料重比顯著高于CHG(P<0.05)，平均日采食量差異不顯著(P>0.05)。此結(jié)果表明，開(kāi)放式舍飼組的羔羊日增重顯著降低，料重比增加。

2.3 舍飼方式對(duì)羔羊血清胰島素及熱休克蛋白的影響

如表5所示，在試驗(yàn)第28 天，OHG羔羊的血清胰島素含量顯著低于CHG(P<0.05)，血清HSP90含量顯著高于CHG(P<0.05)，HSP70含量在兩組間差異不顯著(P>0.05)。此結(jié)果表明開(kāi)放式舍飼組的羔羊受溫度的影響更大，機(jī)體的應(yīng)激水平較高。

表5 不同舍飼方式對(duì)羔羊血清胰島素和熱休克蛋白含量的影響Table 5 Effects of different housing models on serum contents of INS and HSP in lambs

2.4 舍飼方式對(duì)羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

如表6所示，在試驗(yàn)第14 天，OHG羔羊的血清MDA含量顯著高于CHG(P<0.01)。在試驗(yàn)第21天，OHG羔羊的血清MDA含量極顯著高于CHG(P<0.05)，血清GSH-Px和T-SOD活性顯著低于CHG(P<0.05)。在試驗(yàn)第28 天，OHG羔羊的血清 GSH-Px活性顯著低于CHG(P<0.05)，血清T-SOD活性極顯著低于CHG(P<0.01)，血清MDA含量極顯著高于CHG(P<0.01)。此結(jié)果表明，開(kāi)放式舍飼組的羔羊隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，體內(nèi)氧化應(yīng)激逐漸增加。

表6 不同舍飼條件對(duì)羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of different housing condition on serum antioxidant index in lambs

2.5 舍飼方式對(duì)羔羊血清免疫指標(biāo)的影響

如表7所示，在試驗(yàn)第21 天，OHG羔羊的血清IL-1β含量顯著低于CHG(P<0.05)。在試驗(yàn)第28 天，OHG羔羊的血清IL-1β含量極顯著低于CHG(P<0.05)，血清IL-4含量顯著低于CHG(P<0.05)。其余指標(biāo)兩組間差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，開(kāi)放式舍飼組的羔羊隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，血清白介素均下降，免疫水平有所降低。

表7 不同舍飼方式對(duì)羔羊血清白介素和免疫球蛋白的影響Table 7 Effects of different housing models on serum interleukins and immunoglobulins in lambs

2.6 舍飼方式對(duì)羔羊血液白細(xì)胞中HSP、免疫抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖1和圖2所示，在試驗(yàn)第14 天，OHG羔羊白細(xì)胞中抗氧化相關(guān)基因Nrf2和SOD1mRNA表達(dá)量顯著高于CHG(P<0.05)，免疫相關(guān)基因RIP2和NF-κBp65 mRNA 表達(dá)量顯著低于CHG(P<0.05)。在試驗(yàn)第21天，OHG羔羊白細(xì)胞中HSP及抗氧化相關(guān)基因HSP90、Nrf2、GSH-Px和SOD1mRNA表達(dá)量顯著高于CHG(P<0.05)，免疫相關(guān)基因RIP2、NF-κBp50、NF-κBp65、IL-4和TNF-αmRNA表達(dá)量顯著低于CHG(P<0.05)。在第28天，OHG羔羊白細(xì)胞中HSP及抗氧化相關(guān)基因HSF-1、HSP90、Nrf2、CAT、GSH-Px、SOD1和SOD2mRNA表達(dá)量顯著高于CHG(P<0.05)，免疫相關(guān)基因RIP2、NF-κBp50、NF-κBp65、IL-1β、IL-4 和TNF-αmRNA表達(dá)量顯著低于CHG(P<0.05)。其余指標(biāo)在兩組間差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，開(kāi)放式舍飼組的羔羊隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，其血液白細(xì)胞的HSP相關(guān)基因與抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均提高，免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均降低。

以第7天的封閉式舍飼組為對(duì)照，柱上不同上標(biāo)a，b表明試驗(yàn)同一天兩組間存在顯著差異(P<0.05)。下同。CHG group of day 7 was taken as calibrator. The different superscripts on bar indicate a significant difference between the two groups on the same day (P<0.05). The same below.圖1 不同舍飼方式對(duì)羔羊血液白細(xì)胞中HSP及抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different housing models on expression of HSP and antioxidant related genes in blood leukocytes of lambs

圖2 不同舍飼方式對(duì)羔羊血液白細(xì)胞中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different housing models on expression of immune related genes in blood leukocytes of lambs

3 討 論

3.1 冬季兩種不同舍飼方式對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能的影響

低溫環(huán)境會(huì)增加機(jī)體熱損失，動(dòng)物會(huì)提高能量消耗來(lái)維持新陳代謝，造成生產(chǎn)性能降低。綿羊的下限臨界溫度為-3 ℃，在該溫度下，每下降1 ℃，綿羊的日代謝能量需求就會(huì)增加0.14～0.64 MJ(60 kg的綿羊)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，冬季舍外放牧的母羊相較于舍飼的母羊日增重減少了28.39 g/d[21]。韓國(guó)公牛在較冷三月份日增重和飼料效率均低于四月份[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，封閉式舍飼組的舍內(nèi)溫度較開(kāi)放式羊舍高了5.45 ℃，開(kāi)放式舍飼組羔羊的表皮散熱量增加，使其用于維持代謝需求的能量增多，降低了羔羊的日增重與飼料效率，且由于開(kāi)放式舍飼組羔羊的日齡較小，長(zhǎng)期的低溫環(huán)境可能引起食欲下降，進(jìn)而降低了開(kāi)放式舍飼組羔羊的采食量和末體重，但二者均差異不顯著，這可能由于組間溫差較小和組內(nèi)差異較大導(dǎo)致。有相似報(bào)道稱(chēng)，平均溫度為-7.37 ℃的一月與平均溫度為6.22 ℃的三月相比，韓國(guó)公牛的生長(zhǎng)性能不受影響[2]。畜舍內(nèi)的有害氣體也是影響動(dòng)物健康與生長(zhǎng)的重要因素，我國(guó)氨排放的80%來(lái)源于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，畜禽舍內(nèi)大量NH3和CO2會(huì)引起動(dòng)物呼吸道感染，降低動(dòng)物免疫力[16]。本研究表明，封閉式舍飼組內(nèi)NH3與CO2含量均高于開(kāi)放式舍飼組內(nèi)，且兩組舍內(nèi)NH3與CO2含量均高于舍外，但根據(jù)《畜禽場(chǎng)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 388—1999)》可知二者均處于正常畜禽場(chǎng)空氣環(huán)境范圍(NH3<20 mg/m3，CO2<1 500 mg/m3，本研究使用的是氣體檢測(cè)管法，與標(biāo)準(zhǔn)中使用的傳統(tǒng)納式試劑比色法雖有偏差，但也在合理范圍內(nèi)[22])，這可能是由于兩組日均溫度均處于0 ℃以下，排泄物被凍結(jié)，抑制了NH4+向NH3的轉(zhuǎn)化[16]，因此對(duì)機(jī)體的影響較小。

3.2 冬季兩種不同舍飼方式對(duì)羔羊血液熱休克蛋白的影響

HSPs是一類(lèi)高度保守的分子伴侶蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]，低溫環(huán)境下機(jī)體會(huì)提高HSP轉(zhuǎn)錄和翻譯水平適應(yīng)外界環(huán)境的改變，是衡量應(yīng)激大小的重要指標(biāo)[24]。Banerjee等[12]研究發(fā)現(xiàn)冬季在低溫條件下，山羊淋巴細(xì)胞中HSPA1A和HSPA8基因的表達(dá)顯著增加。在本研究中，試驗(yàn)前三周兩組羔羊血清的胰島素、HSP70和HSP90含量影響并不顯著，可能由于試驗(yàn)前三周兩組均受到一定程度的冷暴露，試驗(yàn)期較短且溫差不足以導(dǎo)致差異，但隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，開(kāi)放式舍飼組羔羊的血清HSP90含量和白細(xì)胞HSP90 mRNA表達(dá)水平提高，來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能，幫助機(jī)體適應(yīng)寒冷的環(huán)境。但是對(duì)HSP70卻沒(méi)有影響，可能由于急性冷暴露(在12 h內(nèi))會(huì)增加HSP70的表達(dá)，而慢性冷暴露(在24 h以上)會(huì)恢復(fù)其表達(dá)水平[25]。冷應(yīng)激提高HSP的表達(dá)可能由于胰島素的降低造成的。冷應(yīng)激會(huì)激活交感神經(jīng)，降低血清胰島素水平和增加血清葡萄糖濃度來(lái)補(bǔ)償機(jī)體能量消耗[8]，而胰島素的降低會(huì)通過(guò)類(lèi)胰島素受體衰變加速因子2(DAF-2)釋放HSF-1進(jìn)入細(xì)胞核并與熱休克蛋白原件(HSE)結(jié)合增加HSP轉(zhuǎn)錄水平[26]。因此，開(kāi)放式舍飼組的羔羊與封閉式舍飼組的羔羊相比，血清胰島素含量更低，HSP水平更高，受到的應(yīng)激更大。

3.3 冬季兩種不同舍飼方式對(duì)羔羊血液抗氧化功能的影響

ROS是細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化呼吸產(chǎn)生的自由基活性物質(zhì)，在細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制下通常保持在較低水平，但低溫引起的代謝加強(qiáng)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS[6]，并氧化不飽和脂肪酸產(chǎn)生MDA，抗氧化酶系統(tǒng)可以清除MDA保護(hù)機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激[7]。研究發(fā)現(xiàn)冷暴露下的羔羊血清GSH-Px和CAT活性降低，MDA含量升高[3]。慢性冷應(yīng)激使雞心臟組織中CAT、GSH-Px和SOD活性降低[4]。本研究表明，開(kāi)放式舍飼組的羔羊隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)其血清MDA含量增加，消耗并降低了血清抗氧化酶的活性，而封閉式舍飼組舍內(nèi)的溫度相對(duì)較高，MDA與抗氧化酶水平更為平衡。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子。冷應(yīng)激引起機(jī)體氧化失衡時(shí)，過(guò)量的ROS與HSP90均可與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)相互作用，解離Keap1-Nrf2復(fù)合物釋放Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核激活其下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[10]。研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理的松鼠較常溫飼養(yǎng)下的松鼠心臟組織中Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，Keap1 mRNA表達(dá)量顯著降低[27]。本研究第7天兩組間抗氧化酶基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異，隨著開(kāi)放式舍飼組羔羊的低溫暴露期增長(zhǎng)，其血液白細(xì)胞的Nrf2及其下游抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高，這可能由于血液ROS的大量產(chǎn)生和白細(xì)胞HSP90 mRNA表達(dá)量的提高增加了HSP90-Keap1相互作用，激活了Nrf2及其下游抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄。但值得注意的是，雖然抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，但血清抗氧化酶活性仍下降。這可能由于氧化應(yīng)激會(huì)提高抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)作為機(jī)體的代償保護(hù)作用[28]，加之抗氧化酶催化大量H2O2的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致產(chǎn)物抑制了抗氧化酶的活性，有研究與本研究結(jié)果有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激期間，大蒜提取物處理過(guò)的大鼠肝細(xì)胞中Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)均增加，但抗氧化酶的活性仍低于正常水平[29]。血液在機(jī)體中起著運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等關(guān)鍵作用，在開(kāi)放式舍飼組羔羊受到氧化應(yīng)激時(shí)，體內(nèi)各種組織產(chǎn)生的過(guò)量MDA會(huì)釋放到血液中，造成血液MDA含量升高，而抗氧化酶會(huì)首先運(yùn)輸?shù)叫呐K和肝臟等機(jī)體關(guān)鍵組織，導(dǎo)致了血液的抗氧化酶活性的降低。因此，開(kāi)放式舍飼組羔羊抗氧化酶水平的降低說(shuō)明其機(jī)體正處于氧化失衡，HSP90和Nrf2 mRNA的過(guò)表達(dá)是機(jī)體針對(duì)ROS損傷的保護(hù)機(jī)制。本研究表明，在冬季，開(kāi)放式舍飼方式與封閉式舍飼方式的羔羊相比，血清抗氧化酶活性更低且MDA含量更高，提高舍內(nèi)溫度可緩解羔羊的氧化抗氧化失衡。

3.4 冬季兩種不同舍飼方式對(duì)羔羊血液免疫功能的影響

血清免疫球蛋白是一類(lèi)具有廣泛免疫功能的蛋白質(zhì)分子，它們可以與抗原特異性結(jié)合，激活補(bǔ)體并與細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合以獲得特異性免疫，低溫環(huán)境通常會(huì)使免疫球蛋白的分泌降低。石璐璐等[7]研究發(fā)現(xiàn)慢性冷應(yīng)激顯著降低綿羊血清IgG的含量，IgA與IgM含量也有所下降。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，兩組羔羊的血清免疫球蛋白均呈下降趨勢(shì)，這可能由于持續(xù)的低溫降低了兩組羔羊血清的免疫球蛋白分泌，且由于兩組溫差較小導(dǎo)致兩組間差異不顯著。血液中免疫細(xì)胞因子可以調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)，其含量高低可以反映機(jī)體免疫的狀態(tài)，促炎細(xì)胞因子TNF-α和抗炎細(xì)胞因子IL-4分別是T淋巴細(xì)胞亞類(lèi)Th1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，兩者的異常產(chǎn)生都會(huì)影響免疫和炎癥反應(yīng)。Wei等[4]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期冷暴露顯著降低雞心臟組織中細(xì)胞因子的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著試驗(yàn)時(shí)間的增加兩組羔羊血清的細(xì)胞因子含量均呈下降趨勢(shì)，這可能是兩組舍內(nèi)溫度均低于羔羊的適宜生存溫度，導(dǎo)致Th1和Th2平衡失調(diào)，進(jìn)而降低了細(xì)胞因子IL-4和TNF-α的含量，且在試驗(yàn)后兩周開(kāi)放式舍飼組羔羊血清中促炎細(xì)胞因子IL-1β和抗炎細(xì)胞因子IL-4含量均低于封閉式舍飼組，說(shuō)明開(kāi)放式舍飼組Th1和Th2平衡失調(diào)更為嚴(yán)重，而IL-1β含量的降低可能是由于NF-κB調(diào)控其基因表達(dá)量下降而引起的。NF-κB是與免疫反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NLR)家族成員NOD1可激活NF-κB途徑提高免疫基因的轉(zhuǎn)錄[30]，HSP90在冷應(yīng)激期間可以維持NOD1的穩(wěn)定性，使其處于抑制狀態(tài)降低NF-κB的激活[11]。研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激期間，小鼠下丘腦細(xì)胞中的NF-κB和TNF-αmRNA表達(dá)量顯著下調(diào)[30]。本研究表明，開(kāi)放式飼養(yǎng)組內(nèi)羔羊處于長(zhǎng)期低溫暴露下，HSP90 mRNA表達(dá)量增加，并通過(guò)NOD1抑制NF-κBmRNA表達(dá)，進(jìn)而降低了IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)量。HSP的過(guò)表達(dá)可以幫助機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。HSP的上調(diào)不僅增加了Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控的抗氧化酶的表達(dá)[10]，而且還降低了NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的炎癥和免疫反應(yīng)[11]，且Nrf2與NF-κB也互相影響，最近的研究表明，Nrf2通過(guò)增加抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)抑制NF-κB通路的激活，從而降低ROS介導(dǎo)的NF-κB的激活及炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷[32]。本研究結(jié)果表明，冬季持續(xù)的低溫環(huán)境使兩組羔羊的血清免疫功能均受到一定程度的下降，導(dǎo)致免疫球蛋白的分泌和細(xì)胞因子含量呈下降趨勢(shì)，且開(kāi)放式舍飼組較低的環(huán)境溫度使羔羊血清免疫功能顯著降低。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，在冬季與封閉式羊舍相比，開(kāi)放式羊舍會(huì)降低羔羊的日增重，增加料重比，引起羔羊的免疫水平降低和氧化應(yīng)激，HSP表達(dá)水平的增加，可幫助維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。因此，由于羔羊保溫與產(chǎn)熱能力不足，冬季養(yǎng)殖比起運(yùn)動(dòng)量的增加更需要保溫的作用。