靈芝多糖對脂多糖誘導小鼠肝損傷的保護效應

李向輝 吳艷玲 崔振宇

(1延邊大學藥學院 朝藥研究國家民委重點實驗室，吉林 延吉 133002；2中國人民武裝警察部隊吉林省總隊醫院藥劑科)

近年肝損傷發病率呈上升趨勢，其發病機制較為復雜，尚未闡述明晰，氧化應激和炎癥刺激是肝臟損傷主要病理特征〔1〕。氧化應激是機體內氧化與抗氧化動態平衡被打破的主要狀態，一旦氧化應激形成，不僅是體內氧化與抗氧化的失衡，更重要的是由于失衡所造成的諸多穩態失衡，如中性粒細胞炎性浸潤，氧化中間產物增多誘發的炎癥因子、細胞因子等。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌胞壁內毒素主要成分，而肝臟是腸源性LPS攻擊主要靶器官。LPS通過Th1細胞因子導致肝臟損傷，其誘導小鼠模型可以較好地模擬人肝炎發病的病理過程。

靈芝為多孔菌科真菌赤芝，是一種珍貴的藥食兩用菌。由于靈芝的營養成分豐富且營養價值高，靈芝保健品已在我國甚至國外逐步興起。靈芝多糖(GLP)是靈芝中最有效的成分之一，已分離出200多種，多為β-葡聚糖，多糖鏈呈螺旋立體狀，以氫鍵連接，分子量由幾百至數十萬〔2〕。GLP在熱水中的溶解性極佳，所以能發揮促進血液循環保健功能〔3〕。GLP具有廣泛的藥理作用，可提高機體免疫力和耐缺氧能力。此外，GLP還具有降血糖、降血脂、抗腫瘤等生理功能〔4～6〕。本研究主要探討GLP對LPS誘導小鼠肝損傷的保護效應機制。

1 材料及方法

1.1實驗動物 30只雄性C57L/6小鼠購于長春憶斯動物有限公司〔動物許可證號：SYXK(吉)2020-0010〕。小鼠分組單籠飼養，溫度控制于(25±2)℃，濕度控制為(45±5)%，自由飲食飲水，飼養環境明暗12/12 h循環。動物實驗相關操作均遵循延邊大學實驗動物倫理委員會相關規定。適應性飼養1 w，分為正常組、模型組、GLP低劑量(GLP-L)組(3.75 g/kg GLP)、GLP中劑量(GLP-M)組(7.50 g/kg GLP)、GLP高劑量(GLP-H)組(11.25 g/kgGLP)，分組后每天給藥1次，連續給藥4 w。末次給藥24 h后腹腔注射LPS(10 mg/kg)誘導小鼠急性肝損傷，12 h后麻醉采血，室溫下放置2 h，血清分層后低溫離心，4 000 r/min離心10 min，收集上清保存于-80℃冰箱中備用。收集肝臟組織，-80℃冰箱保存以備后續檢查。

1.2藥材與試劑 GLP制備：靈芝菌絲體100 g，先用乙醇預處理，去除脂類物質，并使糖苷酶失活，防止多糖降解。隨后加入總重量20倍體積的95℃熱水浸提60 min，連續浸提3次，合并3次浸提液，減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，離心，加入75%乙醇反復洗滌，沉淀多糖，獲得粗多糖。采用sevage法去蛋白質，再經硼酸型deae纖維素柱層析法純化。蒽酮-硫酸法測定GLP含量為1.5 mg/g。

1.3主要儀器 電子天平(賽多利斯)；離心機(Sigma)；-80℃冰箱(Haier)；酶標儀(Bio Tek)；臺式高速離心機(德國Sigma)；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，白細胞介素(IL)-1α(上海聯祖生物科技有限公司)。

1.4樣品收集與處理 在末次給藥24 h后，對小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，頸動脈取血，收集的血液樣品經靜置(4℃，60 min)后離心(3 500 r/min，15 min，4℃)得到血清，置于-80℃冰箱保存，用于小鼠血清中ALT、AST、IL-1α指標測定。將肝臟組織剝離后鹽水清洗，濾紙吸干即刻置于液氮中，待冷凍后轉存于-80℃冰箱中，用于SOD、MDA、GSH-Px水平檢測。

1.5血清生化分析 將收集的小鼠血漿，室溫靜置2 h，在4℃下，4 000 r/min離心10 min，收集上清。測定分析小鼠血清ALT、AST、IL-1α水平，按照試劑盒說明書進行測定。

1.6肝臟組織中SOD、GSH-Px及MDA水平檢測 取20 mg肝組織，加入9倍量體積生理鹽水研磨，渦旋混勻3 min，離心(12 000 r/min，15 min，4℃)兩次，獲得上清液，按照試劑盒說明書檢測小鼠肝組織中的SOD、GSH-Px及MDA水平

1.7數據處理 采用GraphPad Prism9.0軟件進行單因素方差分析、Tukey多重比較檢驗。

2 結 果

2.1GLP對LPS誘導的急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響 與正常組比較，模型組血清中AST和ALT活性顯著升高(P<0.001)，說明小鼠急性肝損傷模型造模成功；與模型組比較，GLP-L、GLP-M、GLP-H組均能顯著抑制LPS誘導的肝損傷模型小鼠血清ALT、AST活性的升高(P<0.001)，且呈劑量效應關系。見表1。

2.2GLP對LPS誘導的急性肝損傷小鼠血清IL-1α的影響 與正常組比較，模型組血清IL-1α水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，GLP-L、GLP-M、GLP-H組血清IL-1α水平均顯著降低(P<0.001)，且呈現劑量依賴性。見表1。

2.3GLP對LPS誘導的急性肝損傷小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、MDA活性的影響 與正常組比較，模型組肝臟中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA活性顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，GLP-L、GLP-M、GLP-H組均能顯著抑制LPS誘導的肝損傷模型小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性的降低及MDA活性的升高(P<0.001，P<0.01)。見表1。

表1 各組血清ACT、AST活性和IL-1α水平及肝組織中SOD、GSH-Px、MDA活性比較

3 討 論

肝臟是重要的機體代謝及解毒器官，多種因素可誘發肝損傷，如代謝異常、藥物、酒精、病毒及自身免疫性因素；不及時治療可進展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病〔7～11〕。肝臟損傷時，首先產生大量的活性氧自由基(ROS)，形成氧化應激狀態，干擾機體能量代謝。機體內自由基代謝的平衡主要由抗氧化系統調控，包括SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)等。MDA是脂質過氧化物降解的主要產物，而MDA則間接體現自由基攻擊機體時細胞受損的程度。正常情況下，機體內氧化與抗氧化處于動態平衡，外界刺激造成機體內ROS與活性氮自由基(RNS)等表達量增多，同時機體清除能力卻下降，因此機體氧化與抗氧化的平衡就受到破壞，形成氧化應激。ROS是以氧為中心的活性基團，包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)，這些活性基團可僅有被催化為過氧自由基(ROO-)、烷氧基(RO-)及硫自由基(RS-)，受多種刺激因素機體內堆積大量的未被完全還原的O2進而引發ROS大量激增〔12〕。如酒精刺激，酒精可引起線粒體電子傳遞鏈等功能障礙，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶或活化細胞色素PD459E1(CYP2E1)則可催化分子氧形成大量ROS，進一步抑制脂肪酸氧化，形成酒精性脂肪肝病〔13〕。已有研究發現氧化應激與肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等關系密切〔14〕。

各類因素刺激的ROS激增，不僅造成肝細胞損傷，還可形成脂質過氧化，肝細胞膜脂質過氧化可增加細胞膜的通透性，破壞細胞內膜結構，促進白三烯、血栓素等生物獲悉物質產生，進一步誘發炎癥反應。肝臟損傷時大量炎癥因子釋放，幾乎所有原因所致肝臟疾病中都存在炎癥，而且貫穿疾病的始終，已證實多數肝損傷都伴隨炎癥〔15,16〕。因此以調控氧化應激和炎癥為抓手，針對性治療肝損傷，可以延緩疾病進展，提高患者生活質量〔17〕。

GLP由三股單糖鏈溝通，具有螺旋狀的三級立體構型，其藥理活性與單糖間糖苷鏈結合形式和立體構型密切相關〔18〕。目前利用紫外可見光譜、紅外光譜、氣相色譜質譜聯用、核磁共振等多項技術已分離獲得200余種GLP，對GLP等三旋螺旋梯結構及多糖結構特性進行了全面分析，特別是構效關系也獲得了較大進步，構效關系的繼續深入研究還有大量工作要完善〔19〕。GLP可有效提高機體免疫力，加速血液微循環，消除體內自由基，提高抗病愈病能力。本研究中發現GLP可有效改善LPS誘導小鼠肝損傷中氧化應激，調控SOD、MDA及GSH-Px活性。肝臟損傷時，轉氨酶是肝實質損傷密切相關指標，肝細胞受損則釋放轉氨酶，轉氨酶越高則肝臟損傷越嚴重。轉氨酶種類繁多，如賴氨酸、蘇氨酸及其他α-氨基酸均可參與轉氨基作用并形成特異性轉氨酶，眾多轉氨酶中ALT和AST最為重要，分別參與催化谷氨酸與丙酮酸間及谷氨酸與草酰乙酸間的轉氨作用。本研究結果可見GLP可有效降低LPS誘導肝損傷小鼠血清轉氨酶水平，表明GLP可保護肝細胞受損，防止進一步的肝臟損傷。IL是白細胞、免疫細胞間相互作用的主要細胞因子，發揮傳遞信息，激活或調節免疫細胞，介導T細胞和B細胞的活化、增殖及分化，參與炎癥反應。促炎因子IL-1α的活化通常需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-1的切割，受炎性小體的調控。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(NLRP)3是最具特征性的炎性小體，其可激活IL-1α的成熟。ROS不僅可以引發氧化應激還能參與炎癥級聯反應，ROS可激活NLRP3炎性小體，其激活后進一步通過caspase-1導致IL-1α分泌增多，形成ROS-NLRP3-IL-1α的聯動模式。因此在進一步研究中，本研究發現GLP可以降低LPS誘導畸形肝損傷小鼠血清炎癥因子IL-1α水平，說明GLP通過抑制炎癥因子來改善LPS誘導小鼠肝損傷，也進一步驗證GLP通過抑制調控ROS-NLRP3-IL-1α的聯動模式改善LPS刺激肝細胞損傷。ROS-NLRP3-IL-1α的調控可能有益于GLP對肝損傷的改善作用。綜上所述，GLP在抗LPS誘導小鼠肝損傷方面有明顯的緩解作用，可以作為保肝護肝的有效功能因子制成保健食品或藥物，但具體調控作用機制還需進一步研究。

尋找天然抗氧化劑，降低肝細胞內氧化應激，緩解肝病，對于各類肝病的防治具有重要的研究價值和指導意義。GLP作為眾多天然產物中的佼佼者，對肝損傷有較好的治療效果。相信隨著氧化應激的介導肝病相關信號通路的深入研究，將發現GLP改善肝病的特異靶向治療策略，為GLP臨床應用將提供新的策略和思路。