一種全新腔腸素化合物的合成

梁 輝，符秀娟，陳俊波，胡偉利

(1 海南愛科制藥有限公司，海南 海口 571100；2 海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)教研室，海南 海口 570216)

生物熒光成像技術(shù)是利用熒光素酶和相應(yīng)的底物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)從而產(chǎn)生光能量的一種技術(shù)。此技術(shù)目前已經(jīng)大量使用在生命科學(xué)技術(shù)研究領(lǐng)域，比如細(xì)胞增殖、腫瘤分化、蛋白相互作用等等。

目前生物發(fā)光研究領(lǐng)域中，海腎熒光素酶和腔腸素底物是該領(lǐng)域比較熱門的研究體系之一，從它們被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)至今，已有許多腔腸素衍生物被設(shè)計(jì)并合成出來。科學(xué)家們對(duì)腔腸素衍生物的結(jié)構(gòu)修飾的目的主要有：一是使得它的發(fā)射波長向紅外移動(dòng)更多，如此發(fā)射的光相對(duì)不易被吸收，使得成像更方便。二是加大衍生物的穩(wěn)定性，使之不易被水解或氧化分解，進(jìn)而加強(qiáng)背景信號(hào)。三是發(fā)光的強(qiáng)度得以增加，發(fā)光時(shí)間得以延長。

天然腔腸素主要來自于海洋發(fā)光生物，比如水母、海蜇、海腎等[1-2]。腔腸素衍生物應(yīng)用非常廣泛，其主要應(yīng)用在以下方面：活體成像、實(shí)體腫瘤切除手術(shù)引導(dǎo)；報(bào)告基因檢測；檢測細(xì)胞/組織內(nèi)活性氧(ROS)水平，細(xì)胞和組織內(nèi)的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子能夠增強(qiáng)腔腸素在酶非依賴性的氧化體系中自發(fā)熒光；藥物研發(fā)高通量篩選；監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平[2-5]。

天然腔腸素由于存在著諸多缺點(diǎn)，科學(xué)家們?cè)谇荒c素母核的C-2、C-5、C-6和C-8處做了修飾改變[6-8]，許多腔腸素衍生物被合成出來，但是由于海腎螢光素酶的高度底物特異性，很少能比天然腔腸素更有優(yōu)勢(shì)。因此，尋找活性更好的海腎螢光素酶發(fā)光體系己經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)，同時(shí)也是一個(gè)難點(diǎn)[8-10]。

目前對(duì)于腔腸素衍生物的研究主要是基于天然型腔腸素底物，但由于天然型底物存在發(fā)光波長短，穿透力差，熒光強(qiáng)度較弱，發(fā)光時(shí)間短和水溶性差等缺點(diǎn)，阻礙了腔腸素衍生物的進(jìn)一步研究[11]。根據(jù)文獻(xiàn)查詢結(jié)果，腔腸素衍生物構(gòu)效關(guān)系研究較少，為改善以上缺點(diǎn)，本研究進(jìn)行了5位碳的結(jié)構(gòu)修飾和合成路線工藝研究，以期獲得發(fā)光強(qiáng)度、穿透力、水溶性都較好的腔腸素衍生物。為以后在此結(jié)構(gòu)為底物基礎(chǔ)上合成并篩選具有生物活性的化合物有較大的實(shí)際意義[12]。

本次合成路線設(shè)計(jì)為以6-甲基2-氨基吡嗪為原料，先溴代反應(yīng)得到6-甲基- 5-溴-2-氨基吡嗪，再與對(duì)叔丁基二甲基硅氧基苯硼酸反應(yīng)，再次溴代反應(yīng)得到6-甲基-5-對(duì)叔丁基二甲基硅氧基苯-3-溴--2-氨基吡嗪， 與取代硼酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)后經(jīng)縮合反應(yīng)合成了1個(gè) C-5位腔腸素衍生物化合物[13]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

DF-101S集熱式加熱磁力攪拌器，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；APS-8-26高效液相色譜儀，日本島津公司；GC-2014氣相色譜儀，日本島津公司。

合成所用試劑均為分析純，分析所用為色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 合 成

化合物合成路線設(shè)計(jì)如下：

圖1 化合物合成路線Fig.1 Synthetic route of compounds

(1)化合物1的合成

備好冰浴鍋，安裝好反應(yīng)體系，在三角瓶中加入50 mL三氯甲烷，然后加入2.4 g(20 mmol)原料6-甲基-2-氨基吡嗪，緩慢攪拌溶解，使反應(yīng)溶液降溫至0 ℃，緩慢加入NBS 溴代丁二酰亞胺3.6 g(20 mmol)，加完后撤掉冰浴鍋，使反應(yīng)溶液緩慢升溫至室溫，適當(dāng)?shù)臄嚢杷俣认率狗磻?yīng)體系反應(yīng)12 h。經(jīng)點(diǎn)板薄層分析，確認(rèn)可以停止反應(yīng)，進(jìn)行后處理，布氏漏斗過濾，少量三氯甲烷洗滌，濾液收集后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，所得混合物硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷:甲醇=25:1，F(xiàn)/F)。洗脫液濃縮得到白色固體2.35 g，收率61%。1H NMR δ: 8.11(d，J=0.9 Hz,1 H)，7.82(d，J=1.1 Hz，1 H)，4.78(brs，2 H),1.25(s,3 H)。

(2)化合物2的合成

安裝好反應(yīng)體系后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下往反應(yīng)器中加入化合物1，加入量為1.8 g(9 mmol)，加入硼酸3.5 g(13.5 mmol)，加入三苯基膦氯化鈀0.7 g(0.9 mmol)，緩慢的滴加甲苯70 g，滴加完畢再緩慢加入2 mol/L的碳酸鈉溶液10 mL，加熱反應(yīng)溶液直至使溶液回流，在回流狀態(tài)下反應(yīng)4 h。經(jīng)點(diǎn)板薄層分析，確認(rèn)可以停止反應(yīng)，進(jìn)行后處理，布氏漏斗過濾，收集濾液，使用三氯甲烷分三次萃取，每次30 mL，合并萃取液，使用無水硫酸鎂干燥劑干燥過夜。干燥后的萃取液經(jīng)布氏漏斗過濾，少量三氯甲烷洗滌濾餅，收集濾液進(jìn)行濃縮，所得混合物硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷:甲醇=20:1，F(xiàn)/F)。洗脫液濃縮得到白色固體2.83 g，收率81%。1H NMR δ:8.42(d，J=1.4 Hz,1 H)，8.11(d，J=1.4 Hz，1 H)，7.72(d，J=8.8 Hz，2 H)，6.88(d ，J=8.7 Hz，2 H)，4.60(brs,2 H),1.46(s,3 H),1.05(s,9 H),0.24(s,6 H)。

(3)化合物3的合成

備好冰浴鍋，安裝好反應(yīng)體系，在三角瓶中加入DMSO 25 mL，加入2.5 g(7 mmol)的化合物2，加入0.5 mL水，攪拌溶解。冰浴將反應(yīng)溶液降至0 ℃，緩慢滴加NBS 溴代丁二酰亞胺1.5 g(8 mmol)，加完升溫至室溫，反應(yīng)15 h。經(jīng)點(diǎn)板薄層分析，確認(rèn)可以停止反應(yīng)，進(jìn)行后處理，往反應(yīng)液中加入25 mL水中，用三氯甲烷萃取，飽和食鹽洗滌，無水硫酸鎂干燥過夜。干燥后的萃取液經(jīng)布氏漏斗過濾，少量三氯甲烷洗滌濾餅，收集濾液進(jìn)行濃縮，所得混合物硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷:甲醇=25:1，F(xiàn)/F)。洗脫液濃縮得到白色固體2.4 g，收率82%。1H NMR δ:8.42(s，1 H)，7.78(d, J=8.8 Hz, 2 H),6.93(d, J=8.8 Hz, 2 H)，5.11(brs，2 H),1.35(s,3 H)，0.99 (s，9 H)，0.22(s，6 H)。

(4)化合物4的合成

安裝好反應(yīng)體系，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，往三角瓶中加入Zn粉2.0 g(30.6 mmol)和I2200 mg，加入無水四氫呋喃15 mL，加入無水DMF 10 mL，室溫反應(yīng)至碘棕色消失。緩慢加入芐基溴1.5 mL(12 mmol)，將反應(yīng)液緩慢加熱升溫至80 ℃，反應(yīng)6 h后停止加熱，使反應(yīng)溶液慢慢降溫至室溫，得到混合液1。安裝另外一個(gè)反應(yīng)體系，在另外一個(gè)三角瓶中，加入2.2 g的化合物3，加入三苯基膦氯化鈀0.3 g(0.35 mmol)，緩慢加入15 mL無水DMF和20 mL無水四氫呋喃，得到混合液2。將混合液2緩慢加入混合液1中，室溫反應(yīng)過夜。經(jīng)點(diǎn)板薄層分析，確認(rèn)可以停止反應(yīng)，進(jìn)行后處理，布氏漏斗過濾，收集濾液，使用三氯甲烷分三次萃取，每次30 mL，合并萃取液，使用無水硫酸鎂干燥劑干燥過夜。干燥后的萃取液經(jīng)布氏漏斗過濾，少量三氯甲烷洗滌，收集濾液進(jìn)行濃縮，所得混合物硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷:甲醇=20:1，F(xiàn)/F)。洗脫液濃縮得到淡黃色固體2.1 g，收率55%。1H NMR δ:8.45(S，1 H)，7.90(J=6.9 Hz，2 H)，7.40(J=7.2 Hz，2 H，)，7.35(m，5 H)，6.42(s，2 H)，4.09(s，2 H)，1.35(s,3 H)，1.02 (s，9 H)，0.23(s，6 H)。

(5)化合物5的合成

安裝好反應(yīng)體系，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，往三角瓶中加入0.3 mmol的化合物4，加入10 mL無水乙醇，適當(dāng)攪拌速率下使之溶解，加入1，1-二乙氧基-3-對(duì)羥基苯基丙酮0.6 mmol，加入濃鹽酸1.0 mL，緩慢加熱至反應(yīng)溶液回流，回流反應(yīng)過夜。經(jīng)點(diǎn)板薄層分析，確認(rèn)可以停止反應(yīng)，進(jìn)行后處理，布氏漏斗過濾，收集濾液進(jìn)行濃縮，所得混合物硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷:甲醇=20:l，F(xiàn)/F)。洗脫液濃縮得到淡黃色固體0.25 g，收率35%。1H NMRδ: 8.24(d,J=8.3 Hz,1 H),7.92(d,J=7.6 Hz,1 H),7.76(d,J=8.2 Hz,2 H),7.69(d, J=7.1 Hz,1 H),6.62(d,J=8.4 Hz,2 H),3.90(s,2 H)，1.36(s,3 H)，1.01 (s，9 H)，0.24(s，6 H)。13C NMR δ:157.2, 156.4,152.8,149.2, 143.1, 142.5, 13 8.0, 131.1, 128.9,127.4, 125.3, 121.1, 116.4, 113.2, 111.3, 27.8。

2 討 論

經(jīng)過兩步的溴代反應(yīng)和兩步的偶聯(lián)反應(yīng)，最后縮合閉環(huán)反應(yīng)，其中需要注意反應(yīng)條件的把控，特別是惰性氣體的保護(hù)措施、反應(yīng)溫度，否則會(huì)嚴(yán)重影響反應(yīng)，導(dǎo)致副產(chǎn)物增多和影響收率[14]。第一步到第三步的反應(yīng)收率尚可，后面的化合物4和5的收率偏低，我們進(jìn)行了合成條件的摸索，以提高收率。

化合物4的合成中，混合液1和混合液2的混合溫度、反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)正向進(jìn)行影響較大，溫度太低了反應(yīng)進(jìn)度極其緩慢，溫度太高了，副反應(yīng)和副產(chǎn)物太多，所以，我們?cè)O(shè)計(jì)四個(gè)溫度維度來探索影響產(chǎn)率的溫度。根據(jù)反應(yīng)條件，記錄反應(yīng)情況，結(jié)果如表1所示。

表1 反應(yīng)溫度對(duì)化合物4合成收率的影響

由表1得知，反應(yīng)溫度為0 ℃時(shí)，反應(yīng)向右進(jìn)行非常緩慢，已經(jīng)反應(yīng)了48 h依然未能完全反應(yīng)，仍然留有原料混合液1和混合液2在反應(yīng)體系中，收率也不高，才不到40%。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件下的需求，反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長，維持0 ℃長時(shí)間反應(yīng)的能耗較高，因此，不是最優(yōu)選。而提高反應(yīng)溫度以提高反應(yīng)速度，分別設(shè)置40 ℃和80 ℃兩檔，很顯然，反應(yīng)時(shí)間顯著縮短，最短可以是4 h即可完全反應(yīng)，但由于反應(yīng)溫度過高，副產(chǎn)物較多，產(chǎn)物收率未能超過50%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為溫度為室溫25 ℃是最佳溫度條件，如此反應(yīng)比較溫和，副產(chǎn)物也少，無需加熱或制冷，反應(yīng)能耗需求最低，因此，化合物4的合成溫度條件摸索結(jié)果為25 ℃。

化合物5是縮合閉環(huán)反應(yīng)，由于分子量增大，又有一定的空間位阻，因此縮合反應(yīng)需要激烈的反應(yīng)條件才能更好的向右進(jìn)行，可是溫度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量副反應(yīng)副產(chǎn)物，因此嚴(yán)重影響化合物收率。我們?cè)O(shè)置了三個(gè)溫度梯次來考查反應(yīng)溫度對(duì)收率的影響。結(jié)果如表2所示。

表2 反應(yīng)溫度對(duì)化合物5合成收率的影響

首先是在室溫條件下反應(yīng)，其反應(yīng)時(shí)長較久，反應(yīng)不能完全，經(jīng)過48 h反應(yīng)后，仍然有大量化合物4原材料未反應(yīng)，因此收率自然較低。反應(yīng)溫度提高到40 ℃，反應(yīng)速度有所加快，但是反應(yīng)時(shí)間依然超過一天，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件下摸索打通合成路線這樣的需求，應(yīng)該考慮盡量加快反應(yīng)，減少時(shí)間成本。由此設(shè)置乙醇回流反應(yīng)過夜，原料大部分基本都反應(yīng)了，但溫度較前有所提高，副產(chǎn)物也較前增多不少，收率也就只有35%左右，產(chǎn)出不理想，但在所針對(duì)反應(yīng)溫度維度設(shè)計(jì)中，回流過夜為最佳條件。也許還可以再通過摸索水解條件或其他反應(yīng)條件來改善和提高反應(yīng)產(chǎn)率，此設(shè)想留作他日摸索。

3 結(jié) 論

通過以上實(shí)驗(yàn)，我們得知，整個(gè)合成路線經(jīng)歷了五步反應(yīng)，分別是兩步溴代反應(yīng)、兩步歐聯(lián)反應(yīng)和一步縮合反應(yīng)，溴代反應(yīng)和歐聯(lián)反應(yīng)的合成收率相對(duì)較高，縮合反應(yīng)收率較低，總收率為7.79%，因此需要優(yōu)化反應(yīng)條件。我們對(duì)化合物4和5進(jìn)行了反應(yīng)條件的摸索，結(jié)果是：化合物4的合成中，最佳反應(yīng)溫度為室溫，可以得到最高收率55%；化合物5的合成中，最佳反應(yīng)溫度為回流，反應(yīng)收率為35%。

我們此次項(xiàng)目目標(biāo)是設(shè)計(jì)合成路線，并合成得到化合物5，因此，反應(yīng)條件的優(yōu)化不是最緊迫任務(wù)。化合物5目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性正在試驗(yàn)以驗(yàn)證其離子穩(wěn)定性、發(fā)光強(qiáng)度和發(fā)光時(shí)長。我們后期也希望能夠就C-5位改造物基礎(chǔ)上，再進(jìn)行其他位置的修飾，以期獲得穩(wěn)定性好，發(fā)光強(qiáng)度大和發(fā)光時(shí)長較長的腔腸素衍生物。