內陸濕地與水體甲烷厭氧氧化功能微生物研究進展

沈李東,金靖昊,劉 心

南京信息工程大學生態系,南京 210044

甲烷作為大氣中重要的溫室氣體之一,其濃度仍以每年1.0%—1.2%的速度增加,對當前全球氣候變暖的貢獻率達20%[1]。內陸濕地是甲烷的重要排放源之一,其每年向大氣中排放的甲烷量高達100—200 Tg,約占全球年排放總量的三分之一[2]。全球湖泊甲烷年釋放量為8—48 Tg,為自然源甲烷釋放總量的6%—16%[3],且湖泊甲烷排放量呈逐年增加趨勢[4]。全球河流甲烷年排放量為1.5—26.8 Tg,相當于湖泊甲烷年排放總量的40%[5—6]。河流甲烷排放對全球變暖較為敏感：在溫度增加2 ℃的情景下,河流甲烷排放量將增加8%[7]。水庫碳排放日益受到國內外研究者的關注,據估計全球水庫甲烷年排放量為8.9—22.2 Tg,其單位面積甲烷排放量遠高于其他水生生態系統[8]。

圖1 NC10門細菌主導的亞硝酸鹽型AOM反應及ANME-2d主導的硝酸鹽型、金屬還原型和硫酸鹽型AOM反應Fig.1 NC10 phylum bacteria-mediated nitrite-dependent AOM pathway and ANME-2d-mediated nitrate-,metal-and sulfate-dependent AOM pathwaysANME：甲烷厭氧氧化古菌Anaerobic methanotrophic archaea;AOM:甲烷厭氧氧化Anaerobic oxidation of methane

1 NC10門細菌介導的甲烷厭氧氧化

由于受人類活動(如農田徑流、生活污水排放等)的影響,內陸濕地與水體往往受到不同程度的氮素污染,這為亞硝酸鹽型AOM反應的發生提供了有利條件[38]。至今,已有大量研究發現,亞硝酸鹽型AOM反應及其功能微生物NC10門細菌存在于內陸濕地,以及湖泊、河流、水庫等各種淡水水生生態系統中(表1)。

內陸濕地作為全球最重要的碳庫之一,其甲烷排放通量與微生物控制機制備受關注[63]。長期以來,甲烷好氧氧化被認為是控制濕地系統甲烷排放的唯一重要生物途徑[64]。近年來,亞硝酸鹽型AOM反應作為濕地甲烷匯的貢獻受到了國際、國內學術界的廣泛關注。Hu等[15]利用13CH4穩定性同位素示蹤和分子生物學手段,首次報道了淡水濕地系統中存在亞硝酸鹽型AOM反應及其功能微生物NC10門細菌。據估算,由此類AOM反應所致的甲烷氧化量為4.1—6.1 Tg/a,約占全球濕地甲烷年排放通量的2%—6%[15]。隨后,不斷有證據表明,不同天然淡水濕地[16—17,34,39],以及潮汐流濕地[20]、垂直流濕地[44—45]、表面流濕地[46]和城市濕地[42—43]中均存在亞硝酸鹽型AOM反應,以及NC10門細菌的分布。不同類型濕地中亞硝酸鹽型AOM的甲烷氧化活性較為接近,NC10門細菌的絕對豐度多數為105—107拷貝/g(土壤)(表1)。Zhang等[20]研究表明,潮汐流濕地中亞硝酸鹽型AOM反應對土壤甲烷氧化的貢獻率為9.5%—26.3%,暗示了該類甲烷氧化反應在控制濕地甲烷排放中起了重要作用。最近,亞硝酸鹽型AOM反應在氮素轉化中的作用開始受到關注[20,45]。如有研究發現,此類AOM反應在濕地土壤氮氣產生中的貢獻率高達20.7%—40.1%[20]。此外,濕地土壤中亞硝酸鹽型AOM的甲烷氧化活性及NC10門細菌的分布存在空間異質性。多數研究表明,深層土壤(20—60 cm)是亞硝酸鹽型AOM反應的活躍區,亦是其功能微生物分布的峰值區[15—16,39,42,44]。這是由于深層土壤相對穩定的缺氧條件和高濃度甲烷,更有利于NC10門細菌的生長和代謝[39]。濕地中亞硝酸鹽型AOM反應作用強度的空間變異還受土壤無機氮、有機碳等水平的影響[16,20,34]。但目前,針對濕地中亞硝酸鹽型AOM的時間變異性研究較少[16]。多時空尺度下亞硝酸鹽型AOM反應及其功能微生物的研究,將有助于更好地評估此類生物過程在濕地甲烷減排中的貢獻及其環境調控機制。

續表生態系統Ecosystems電子受體Electron acceptors甲烷厭氧氧化活性Activity of anaerobic methane oxidation/(nmol CO2 g-1 d-1)功能微生物Functional microbes甲烷厭氧氧化微生物豐度Abundance of anaerobic methanotrophs/(拷貝/g)參考文獻References?rn湖(丹麥)Lake ?rn (Denmark)Fe(III)Fe(III)/SO42-1.8 nmol cm-3 d-1NDNDANME-2dNDND[56][35]錢塘江Qiantang RiverNO-2NDNC101.3×106—1.0×107 (16S rRNA)[26]東江Dongjiang RiverNO-2NDNC109.1×104—3.0×106 (pmoA)[57]渾河Hunhe RiverNO-2NDNC10ND[58]北運河(北京)North Canal (Beijing)NO-2NDNC10ND[59]英格蘭內陸河流Inland rivers in EnglandNO-2NO-3Fe3+SO42-0.4—61.00.5—5.71.5—8.10.6—4.4NC10ANME-2dANME-2dANME-2d3.7×106—1.5×107 (16S rRNA)2.1×104—2.5×105 (16S rRNA)[25][25]三峽水庫Three Gorges ReservoirNO-2NDNC104.7×102—1.8×105 (16S rRNA)[60-61]新豐江水庫Xinfengjiang ReservoirNO-2NDNC108.0×104—1.0×106 (16S rRNA)[62]印度大壩水庫Dam-reservoirs in IndiaNO-2NDNC10ND[28]九龍湖水庫Jinglonghu ReservoirNO-2NO-34.7—14.10.8—2.6NC10ANME-2d8.6×107—2.8×108 (16S rRNA)3.7×105—4.8×105 (16S rRNA)[29][29]

2 ANME- 2d介導的甲烷厭氧氧化

2.1 硝酸鹽型甲烷厭氧氧化

2.2 金屬還原型甲烷厭氧氧化

目前對于ANME-2d是如何利用鐵、錳等難溶的金屬電子受體,其電子轉移機制是什么,尚存在爭論。從現有研究來看,主要的電子轉移機制可能存在以下兩種。一種為胞外電子直接轉移(圖1)。Ettwig等[72]通過宏基因組發現,富集培養物中的ANME-2d含有大量編碼細胞色素c的基因。細胞色素c在電子從胞內傳至胞外以及細胞間傳遞過程中起著至關重要的作用。但有關ANME-2d的細胞色素c在不同金屬電子受體存在條件下的表達仍需進一步驗證。另一種電子轉移途徑為種間電子轉移機制(圖1)。Fu等[73]向ANME-2d富集培養物中添加異化鐵還原菌ShewanellaoneidensisMR-1,發現ANME-2d和鐵還原菌的豐度在培養過程中均有增加。他們認為ANME-2d和鐵還原菌可能是通過電子穿梭體、細胞色素蛋白載體、納米導線等方式協同完成電子轉移過程[73]。此外,Lu等[74]通過向ANME-2d富集培養物中加入Cr(VI),觀察到甲烷氧化伴隨Cr(VI)還原的現象。這可能是ANME-2d和一種未知的Cr(VI)還原微生物共同完成了AOM耦合Cr(VI)還原過程[74]。

雖然富集培養物中的ANME-2d能催化鐵、錳等(無論是可溶性金屬離子還是不溶性金屬氧化物)金屬還原型AOM反應,但有關天然水體中ANME-2d介導的金屬還原型AOM的研究還相當匱乏(表1)。內陸水體(特別是湖泊、河流等)沉積物容納了來自流域自然風化及人為排放的包括鐵、錳在內的各種金屬元素,這為金屬還原型AOM反應提供了電子受體來源。早期研究者依據元素的生物地球化學和同位素特征判斷,湖泊生態系統中存在鐵還原型或錳還原型AOM反應,但未涉及相關功能微生物的研究[54—56]。Weber等[35]在丹麥低硫高鐵沉積物中檢測到了AOM反應,且通過穩定性同位素核酸探針技術(RNA-based stable isotope probing,RNA-SIP)揭示了ANME-2d介導了Fe(III)還原型和(或)硫酸鹽型AOM反應。Shen等[25]通過反轉錄實時熒光定量PCR發現,在13CH4+Fe3+泥漿培養體系中ANME-2d的mcrA基因顯著表達,證明了此類古菌可催化河流沉積物中Fe(III)還原型AOM反應。但目前,有關內陸濕地與水體中是否普遍存在ANME-2d介導的Fe(III)和Mn(IV)還原型AOM反應,及其主要功能微生物類群有待更深入的研究。

最近,Shi等[36]揭示了天然濕地土壤中存在AOM耦合砷(V)還原的現象。他們利用同位素標記實驗發現,濕地環境中AOM反應會促進土壤結合態砷酸鹽向水溶性更高的亞砷酸鹽轉化,其中26.4%—49.2%的砷釋放被認為是由AOM反應所致。但砷還原型AOM反應在減少濕地甲烷排放中貢獻率較低,最高僅約0.7%。Shi等[36]還通過熒光定量PCR和宏基因組測序等分子生物學手段,分析了參與砷還原型AOM反應的功能微生物,并初步構建了AOM耦合砷還原的代謝通路。結果表明,ANME(ANME-1與ANME-2)首先通過逆甲烷生成途徑活化甲烷并獲得電子,隨后將電子傳遞給細胞周質中的砷還原酶或者共生的砷還原菌中,進一步實現砷的還原[36]。

2.3 硫酸鹽型甲烷厭氧氧化

一般認為,硫酸鹽型AOM反應在淡水環境中不易發生,其原因是淡水水體中硫酸鹽濃度較低(通常僅為海洋環境的1%不到)。但有研究表明,硫酸鹽濃度似乎并不是制約硫酸鹽型AOM反應發生與否的決定性因素,即使在低硫酸鹽環境中亦可發生此類甲烷氧化反應。其發生機制可能是在缺氧環境下硫酸鹽可同時進行氧化和還原反應,比如硫酸鹽被還原成硫化物后又可在溶解性有機物或金屬氧化物存在的情況下被重新氧化,從而構成了硫酸鹽與硫化物的循環體系[75—76]。

不同于NC10門細菌,ANME-2d是一類多功能的甲烷代謝菌,它們除了可以催化硝酸鹽型AOM及Fe(III)、Mn(IV)、Cr(VI)等金屬還原型AOM反應外,還能催化硫酸鹽型AOM反應[33]。由于ANME-2d基因組中缺少異化硫酸鹽還原酶編碼基因,此類古菌被認為不能獨立催化完成硫酸鹽型AOM反應,需與其它菌協同完成[77]。Nie等[33]研究發現,ANME-2d富集培養物中存在AOM耦合硫酸鹽還原的現象,并認為ANME-2d和硫酸鹽還原菌協同完成了硫酸鹽型AOM反應。他們利用掃描電子顯微鏡觀察到培養物中存在納米網絡結構,并通過宏轉錄組發現,ANME-2dflaB基因(編碼古菌鞭毛合成的基因)以及脫硫球菌pilA基因(編碼菌毛合成的基因)的表達均顯著上調。由此認為,該納米網絡結構主要由ANME-2d的鞭毛和脫硫球菌的菌毛形成。ANME-2d在執行AOM反應的同時,通過納米網絡將電子傳遞給脫硫球菌實現硫酸鹽的還原[33](圖1)。

3 甲烷厭氧氧化功能微生物的分子生物學檢測方法

由于尚未獲得純培養,對自然生境中NC10門細菌和ANME-2d等AOM功能微生物的檢測主要依賴分子生物學手段,如聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)、變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等[78—79]。表2總結了當前用于測定環境中NC10門細菌和ANME-2d常用的PCR引物,其主要是針對它們的16S rRNA或功能基因。近年來,高通量測序已被廣泛應用于微生物生態學研究中。目前,有不少研究者采用高通量測序技術(如Illumina Miseq)對環境樣品中NC10門細菌和ANME-2d群落進行分析[16,29,34,87]。此外,Graf等[23]利用宏轉錄組手段分析了深水湖泊中NC10門細菌相關基因的轉錄水平,并結合宏基因組手段獲得了一新的NC10門菌株的全基因組序列。另有研究者利用獨特的脂肪酸生物標志物,對泥炭地環境樣品中NC10門細菌進行了檢測[88]。新的分子生物學手段的不斷發展,將極大地推動對內陸濕地和水體環境中AOM功能微生物分布特征的理解。

表2 用于檢測NC10門細菌和ANME-2d常用的PCR引物Table 2 PCR primers commonly used for detection of NC10 phylum bacteria and ANME-2d

4 甲烷厭氧氧化活性測定的同位素示蹤技術

5 問題與展望

5.1 不同AOM途徑的功能微生物

5.2 不同AOM途徑在甲烷減排中的相對貢獻

5.3 不同AOM途徑在相關物質循環中的作用

現有的研究更多的是關注AOM反應在內陸濕地與水體甲烷減排中的貢獻,很少量化其在其它物質循環中的作用[20,45,53]。事實上,亞硝酸鹽型和硝酸鹽型AOM反應在消減水體氮素污染物,以及金屬還原型AOM反應在調節鐵、錳等元素沉積方面的作用也不容忽視。采用穩定性同位素示蹤與組學相結合的手段,有助于認識不同AOM途徑在相關物質循環中的作用。

5.4 不同AOM途徑的主要影響因素

當前關于內陸濕地與水體中不同AOM途徑影響因素的研究,很少涉及宏觀環境因子和人類活動等對AOM的影響。例如氣候變化(大氣CO2濃度升高和氣候變暖等)對AOM過程會產生何種影響不得而知。研究表明,大氣CO2濃度升高或氣候變暖可通過促進植物光合作用,增加植物根系生物量,增強根系分泌物代謝,以及改變土壤理化性質等間接影響甲烷好氧氧化過程[90—91]。同樣,氣候變化很可能會對AOM過程產生影響。開展氣候變化背景下AOM的研究,將有利于更好地評價相關微生物在減緩氣候變化中的作用。另外,人為活性氮排放亦會對AOM過程產生影響[29],尤其會對河流、湖泊、水庫等水生生態系統中亞硝酸鹽型和硝酸鹽型AOM過程產生影響。對于稻田系統中的AOM過程,其會受各種農業管理措施(如施肥、水分管理方式、耕作制度等)的影響。探明不同管理措施對AOM過程的影響,可以更好地評估AOM在稻田甲烷氧化中的貢獻,同時為稻田甲烷減排提供科學依據。