高通量測(cè)序分析凍融期碳源輸入方式對(duì)土壤線蟲群落的影響

劉 月,張利敏,徐勝楠,王 瑤,于鴻淼,王思琪

哈爾濱師范大學(xué)寒區(qū)地理環(huán)境監(jiān)測(cè)與空間信息服務(wù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150025

作為土壤碳庫(kù)的重要組成部分,土壤有機(jī)碳(SOC)為土壤生物提供了其生存所需要的養(yǎng)分[1]。土壤有機(jī)碳主要來(lái)源于植被地上和地下的輸入,自然狀態(tài)下經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的積累,總量巨大,因而短期內(nèi)難以檢測(cè)到較明顯的變化[2]。為了更深入探究土壤有機(jī)碳對(duì)土壤生物以及地下生態(tài)系統(tǒng)的影響,Francis Hole 博士早在20世紀(jì)50年代就設(shè)置了改變碳源輸入方式的實(shí)驗(yàn),即植物殘?bào)w(凋落物及根系)的去除和添加實(shí)驗(yàn)(detritus input and removal treatments,DIRT),由去除凋落物處理、去除根系處理、去除凋落物和根系處理以及加倍添加凋落物處理等組成[3]。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)控制地表凋落物和根系來(lái)探究地上部分植物與土壤生物之間的關(guān)系,以便在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)觀測(cè)到土壤有機(jī)碳的變化,進(jìn)一步對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響進(jìn)行研究。大量的研究表明,植物碳輸入方式的變化會(huì)對(duì)土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。Lajtha等[4]在美國(guó)安德魯斯實(shí)驗(yàn)森林的針葉林中建立了一項(xiàng)野外控制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),5年來(lái)通過(guò)阻隔地上和地下凋落物輸入,該地塊的土壤表現(xiàn)出土壤有機(jī)碳和有機(jī)氮逐年下降的現(xiàn)象。Kabzems等[5]研究發(fā)現(xiàn),在落葉喬木林中,去除凋落物引起的表層土壤總有機(jī)碳的下降比去除植物體本身所產(chǎn)生的效果更明顯。此外,植物碳源變化造成的土壤環(huán)境的改變又進(jìn)一步影響著土壤生態(tài)系統(tǒng)的生物群落[6]。然而,目前關(guān)于植物碳源輸入方式變化的研究多集中于對(duì)土壤理化性質(zhì)及碳循環(huán)方面[7—8],而對(duì)如何影響土壤線蟲群落卻知之甚少[9]。

線蟲是土壤食物網(wǎng)中最豐富的無(wú)脊椎動(dòng)物[10],具有適應(yīng)能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)類群豐富、生活周期較短、對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)迅速等特點(diǎn),被廣泛用于評(píng)估土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)功能以及土壤環(huán)境質(zhì)量[11]。由此本文推測(cè),不同的植物碳源輸入方式所引起的土壤環(huán)境的改變,也必然會(huì)對(duì)線蟲的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此,本研究通過(guò)對(duì)土壤線蟲的研究來(lái)反映有機(jī)碳輸入對(duì)環(huán)境的影響。但是,以往線蟲群落多樣性的研究多采用形態(tài)學(xué)鑒定的方法,鑒定過(guò)程難度大,且易受環(huán)境及其他因素干擾,因此需要研究者具備較為專業(yè)的知識(shí)素養(yǎng)和豐富的經(jīng)驗(yàn)[12]。伴隨著分子生物方法的發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)在線蟲方面的研究也取得了一定的進(jìn)展[13]。該技術(shù)克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的很多不足,大大減少了勞動(dòng)時(shí)間,提高了工作效率,為鑒定土壤線蟲提供了一種相對(duì)經(jīng)濟(jì)有效的方法[14]。因此,本研究利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)來(lái)分析土壤線蟲群落的組成以及生態(tài)多樣性特征等。

春季凍融期是高緯度地區(qū)特有的時(shí)期,期間的凍融作用是該區(qū)域土壤生態(tài)的影響因素之一[15]。以往的研究表明凍融作用以及凍融期特有的氣溫差異會(huì)直接或間接對(duì)土壤生物產(chǎn)生影響[16]。但是就目前的研究結(jié)果看來(lái),凍融時(shí)期的土壤生物群落變化特征還具有一定的不確定性。一方面,林尤偉等[17]對(duì)小興安嶺不同林型的土壤微生物量研究發(fā)現(xiàn),凍融作用使得土壤食物網(wǎng)中微生物繁殖所需的資源基質(zhì)增加。Zhou等[18]研究發(fā)現(xiàn),凍融時(shí)期的土壤微生物和根系二者之間的促進(jìn)和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,刺激了微生物的繁殖。另一方面,研究還發(fā)現(xiàn),春季凍融期溫差變化導(dǎo)致了表層植物根系以及土壤微生物死亡,進(jìn)而造成微生物分解的速率下降[19]。凍融時(shí)期的土壤線蟲對(duì)土壤有機(jī)碳變化的響應(yīng)是否具有一個(gè)獨(dú)特的模式,還尚不明確。因此,本文利用Illumina MiSeq技術(shù),通過(guò)比較凍融期碳源輸入的四種處理方式,即凋落物和根系同時(shí)輸入(CK)、僅根系輸入(NL)、僅凋落物輸入(NR)以及無(wú)碳源輸入(NLR)下土壤線蟲群落結(jié)構(gòu),多樣性以及生態(tài)指數(shù)的變化情況,揭示土壤線蟲群落的響應(yīng)機(jī)制,探討地上、地下碳源輸入改變后土壤微食物網(wǎng)的變化趨勢(shì),為研究土壤碳循環(huán)中土壤動(dòng)物的重要作用奠定基礎(chǔ)。根據(jù)以往的研究,本文假設(shè)(1)僅凋落物輸入處理(NR)導(dǎo)致的地下碳分配變化會(huì)減少土壤線蟲的食物量,進(jìn)而降低食細(xì)菌線蟲和食真菌線蟲的相對(duì)豐度；(2)與其他限制碳源的輸入方式相比,無(wú)碳源輸入處理(NLR)的土壤線蟲的均勻度和多樣性必然會(huì)降低。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地設(shè)在黑龍江帽兒山森林生態(tài)系統(tǒng)觀測(cè)研究站,地理坐標(biāo)為45°24′N,127°28′E。氣候?yàn)榇箨懶詼貛Ъ撅L(fēng)氣候,年平均氣溫2.8 ℃,年平均降水量723 mm。地帶性土壤為暗棕色森林土壤,母巖為花崗巖。植被為天然次生林及人工林[20]。該地區(qū)主要的天然次生林樹(shù)種有白樺BetulaplatyphyllaSuk.、山楊PopulusdavidianaDode、黃菠蘿PhellodendronamurenseRupr.、胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim.、水曲柳FraxinusmandschuricaRupr.、色木槭AcerpictumThunb.exMurray、椴樹(shù)TiliatuanSzyszyl.等,主要的人工林樹(shù)種有紅松PinuskoraiensisSiebold.etZuc.、落葉松Larixgmelinii(Rupr.)Kuzen.等。

1.2 樣地布設(shè)和土壤樣品采集

于2017年7月,在天然次生林中分別設(shè)置4個(gè)面積為400 m2(20 m×20 m)的樣地,分別在每個(gè)樣地進(jìn)行不同碳源輸入處理,處理方式包括：凋落物和根系同時(shí)輸入處理(Control treatment,CK),僅根系輸入處理(Litter removal treatment,NL),僅凋落物輸入處理(Root removal treatment,NR)以及無(wú)碳源輸入處理(Litter and root removal treatment,NLR)。具體的處理方式如下：凋落物和根系同時(shí)輸入處理(CK)：不做處理；僅根系輸入處理(NL)：用尼龍網(wǎng)兜將凋落物與樣地土壤隔離,將尼龍網(wǎng)兜上的凋落物每月清理一次,直至網(wǎng)內(nèi)再無(wú)凋落物;僅凋落物輸入處理(NR)：在樣方四周挖深度1 m壕溝,切斷根系后用塑料膜隔開(kāi),以阻止根系進(jìn)入;無(wú)碳源輸入處理(NLR)：按上述方法進(jìn)行去除根系處理,并在樣方內(nèi)設(shè)置尼龍網(wǎng)兜,按月將凋落物取出。樣地之間間隔大于100 m,以防止相互之間的干擾,每塊樣地設(shè)置3個(gè)1.5 m×1.5 m的樣方作為重復(fù)處理,共計(jì)12個(gè)樣方。

土壤樣品采集于2019年3月,在每個(gè)小區(qū)選取四個(gè)點(diǎn)(位于樣方四個(gè)角),用內(nèi)徑為3.5 cm的土鉆采集0—10 cm土壤層樣品,挑除碎石以及植物根系,充分混合均勻后裝入無(wú)菌袋中保存。將12個(gè)土壤樣品分別分為兩份：一份用于提取土壤線蟲DNA,另一份風(fēng)干后過(guò)100目篩,進(jìn)行土壤理化性質(zhì)測(cè)定。樣地土壤理化性質(zhì)如表1示。

表1 不同碳源輸入方式下土壤理化性質(zhì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 1 Soil physical and chemical properties under different carbon input methods(Mean±SD)

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用Power Soil DNA Extraction Kit(MoBio)對(duì)土壤樣品進(jìn)行總DNA抽提,利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA抽提質(zhì)量。采用兩步 PCR 擴(kuò)增的方法,首先采用特異引物(內(nèi)側(cè)引物)擴(kuò)增目的片段,將目的片段進(jìn)行膠回收,而后將回收產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二次 PCR 擴(kuò)增(外側(cè)引物)。第一次PCR擴(kuò)增前設(shè)計(jì)引物為：F內(nèi)側(cè)引物：5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特異引物-3′,F 外側(cè)引物：5′-AATGATACGGCGAC CACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTC-3′。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收,回收產(chǎn)物進(jìn)行二次 PCR 擴(kuò)增。第二次PCR擴(kuò)增前設(shè)計(jì)引物為：R 內(nèi)側(cè)引物：5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特異引物-3′,R 外側(cè)引物：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收,回收產(chǎn)物進(jìn)行qPCR定量。在 Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序(2×300 bp),建庫(kù)并測(cè)序(微基生物有限公司,上海)。

1.4 線蟲生態(tài)指標(biāo)

線蟲屬優(yōu)勢(shì)度的劃分：相對(duì)豐度為10%以上者為優(yōu)勢(shì)屬,1%—10%為常見(jiàn)屬,1% 以下為稀有屬。

根據(jù)取食習(xí)性將土壤線蟲劃分為食細(xì)菌線蟲(Bacterivores)；食真菌線蟲(Fungivores)；捕食/雜食線蟲(Omnivores/predators)；植食線蟲(Plant-parasites)四個(gè)營(yíng)養(yǎng)類群[21]。

(2)Pielou均勻性指數(shù)(J)：J=H′/lnS；S為鑒定分類單元的數(shù)目。

(4)總成熟度指數(shù)(Maturity Index,MI)：MI=∑c(i)×p(i)；c(i)為第i種線蟲的生活史策略c-p值；p(i)為第i種線蟲在線蟲總數(shù)中所占比重。

(5)線蟲通路比值[22](NCR)：食細(xì)菌線蟲與食細(xì)菌線蟲和食真菌線蟲數(shù)量之比,即NCR=B/(B+F)；其中,B和F分別代表食細(xì)菌和食真菌的線蟲數(shù)量。

目前應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)線蟲群落的研究尚不成熟,存在文庫(kù)不完善等現(xiàn)象[23]。這導(dǎo)致各碳源輸入處理中出現(xiàn)較多未分類線蟲屬,因而無(wú)法對(duì)線蟲進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)類群的劃分以及生態(tài)指標(biāo)的計(jì)算。因此,本研究在劃分土壤線蟲營(yíng)養(yǎng)類群,以及計(jì)算多樣性指數(shù)和生態(tài)指數(shù)時(shí)將未分類線蟲屬排除,即基于已測(cè)得的68個(gè)線蟲屬進(jìn)行分類和計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

利用SPSS 20.0 軟件分析土壤理化性質(zhì)差異、測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)差異、營(yíng)養(yǎng)類群的相對(duì)豐度以及生態(tài)指數(shù)差異,采用 one-way ANOVA 進(jìn)行線蟲數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。土壤線蟲群落的生態(tài)指標(biāo)使用R軟件以及Excel 2010進(jìn)行計(jì)算。運(yùn)用R軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis,PCoA)以及冗余分析(Redundancy analysis,RDA)。其余圖形繪制使用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)Illumina高通量測(cè)序分析得到的不同碳源輸入方式下土壤中有效序列總數(shù)為493186條,平均每個(gè)樣品的有效序列為41099條。優(yōu)化序列數(shù)如表2所示。覆蓋率指數(shù)展示了研究的土壤樣品文庫(kù)的覆蓋程度,測(cè)序的序列被覆蓋到的越全面,數(shù)值則越高,本試驗(yàn)覆蓋率能夠反映各土壤樣本線蟲群落的真實(shí)情況[24](表2)。

2.1 碳源輸入方式對(duì)土壤線蟲群落組成的影響

2.1.1OTU組成分析

聚類后注釋得到 CK均值為872個(gè)OTU,NL中均值為1032個(gè)OTU,NR中均值為799個(gè)OTU,NLR中均值為1095個(gè)OTU(表2)。本文中不同碳源輸入方式下土壤線蟲群落OTU韋恩圖結(jié)果(圖1)表明CK中獨(dú)有的OTU占總OTU的16.80%(638),NL獨(dú)有的OTU占20.30%(771),NR獨(dú)有的OTU占14.69%(558),NLR獨(dú)有的OTU占22.59%(858)。此外,CK與NL單獨(dú)共有的OTU數(shù)量最多,為61,CK與NR單獨(dú)共有的OTU數(shù)量最少,為26,CK與NLR共有的OTU數(shù)量為31。CK,NL,NR,NLR不同碳輸入下土壤中共有的線蟲OTU數(shù)量為60。

表2 不同碳源輸入方式下土壤線蟲測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 2 Statistics of soil nematode sequencing data under different carbon input methods(Mean±SD)

圖1 基于OTU豐度的不同碳源輸入方式下土壤線蟲群落維恩圖Fig.1 Venn diagram of soil nematode community under different carbon source input methods based on OTU abundanceCK：凋落物和根系同時(shí)輸入Control；NL：僅根系輸入Litter removal；NR：僅凋落物輸入Root removal；NLR：無(wú)碳源輸入Litter and root removal；圖中數(shù)字分別代表不同碳源輸入方式下獨(dú)有以及共有OTU的數(shù)量

2.1.2基于屬水平不同碳源輸入方式下土壤線蟲相對(duì)豐度

為了解碳源輸入方式對(duì)土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)的影響,對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種檢測(cè)和注釋。在排除各碳源輸入處理中未注釋OTU(Unclassified)后,得到已注釋的OTU被識(shí)別為2綱,13目,54科,68屬,104種。基于已注釋線蟲屬水平的相對(duì)豐度進(jìn)行分析,各碳源輸入處理中的優(yōu)勢(shì)屬和常見(jiàn)屬的種類總共為28(圖2),相對(duì)豐度低于1%的稀有屬的種類為40(表3)。CK中土壤樣品中常見(jiàn)屬有異色矛屬(Achromadora),似雙胃屬(Diplogasteroides),Paralamyctes,桿咽屬(Rhabdolaimus)等。NL中土壤樣品中優(yōu)勢(shì)屬為棱咽屬(Prismatolaimus),常見(jiàn)屬為桿咽屬(Rhabdolaimus),墊咽屬(Tylencholaimus),異色矛屬(Achromadora)等。NR中土壤樣品中優(yōu)勢(shì)屬為桿咽屬(Rhabdolaimus),常見(jiàn)屬為銼齒屬(Mylonchulus),異色矛屬(Achromadora),微矛屬(Microdorylaimus)等。NLR中土壤樣品中常見(jiàn)屬為三裂體屬(Trischistoma),小桿屬(Rhabditis),棱咽屬(Prismatolaimus),矛線屬(Dorylaimus)等。不同碳源輸入處理下的稀有線蟲屬如表3所示,其中真單宮屬(Eumonhystera),異頭葉屬(Heterocephalobus),巴氏屬(Bastiania),絲尾墊刃屬(Filenchus),盤旋屬(Rotylenchus)以及無(wú)孔小咽屬(Aporcelaimellus)分布于各碳源輸入處理中。

表3 不同碳源輸入方式下土壤線蟲群落稀有屬組成Table 3 Composition of rare genus in soil nematode community under different carbon input methods

從食細(xì)菌線蟲的組成來(lái)看(圖2),NR中桿咽屬(Rhabdolaimus)和無(wú)咽屬(Alaimus)的相對(duì)豐度大大提升,分別是CK 的2.07倍和2.34倍。NL中食細(xì)菌線蟲棱咽屬(Prismatolaimus)的相對(duì)豐度遠(yuǎn)大于CK和NR,是CK的3.69倍,以及NR的4.57倍。從食真菌線蟲的組成來(lái)看,NL中食真菌線蟲墊咽屬(Tylencholaimus)的相對(duì)豐度大大增加。從捕食雜食線蟲的組成來(lái)看,NR中的銼齒屬(Mylonchulus)和微矛屬(Microdorylaimus)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他碳源輸入方式的樣地。此外,在NLR中,三裂體屬(Trischistoma)的相對(duì)豐度大大增加。

圖2 不同碳源輸入方式下土壤線蟲群落優(yōu)勢(shì)屬和常見(jiàn)屬的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of dominant and common genus in soil nematode communities under different carbon input methods

2.1.3碳源輸入方式對(duì)土壤線蟲營(yíng)養(yǎng)類群的影響

由圖3可知,不同碳源輸入方式下均為食細(xì)菌線蟲的比例最大,最高能達(dá)到38.30%,是土壤線蟲的優(yōu)勢(shì)營(yíng)養(yǎng)類群。和CK相比,NR中食細(xì)菌線蟲的相對(duì)豐度有所上升(P>0.05),而食真菌線蟲則呈現(xiàn)出與食細(xì)菌類線蟲相反的趨勢(shì)(P<0.05)。捕食雜食線蟲在NL中相對(duì)豐度變化不明顯(P>0.05),而在NR中相對(duì)豐度均大幅度上升,分別較CK增加了12.35%(P<0.05)。此外,NR降低了植食線蟲的相對(duì)豐度(P>0.05)。

圖3 不同碳源輸入方式下各營(yíng)養(yǎng)類型的線蟲相對(duì)豐度 Fig.3 Relative abundance of nematodes in different nutrient types under different carbon input methodsBF：食細(xì)菌線蟲Bacterivores；FF：食真菌線Fungivores；OP：捕食/雜食線蟲Omnivores/Predators;PP：植食線蟲Plant-parasites

2.2 碳源輸入方式對(duì)土壤線蟲生態(tài)指數(shù)的影響

不同碳源輸入方式下土壤線蟲群落生態(tài)學(xué)指數(shù)分析結(jié)果如表4所示,多樣性指數(shù)(H′)表現(xiàn)為NR中最高,NLR中最低,表明去除凋落物和根系后土壤線蟲群落的多樣性降低,生態(tài)環(huán)境變差。NR中均勻度指數(shù)(J)最高,該群落較為穩(wěn)定。優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(Dom)為在NLR中最高。成熟度指數(shù)(MI)反映的是土壤資源的多樣化[25],本文中線蟲成熟度指數(shù)(MI)表現(xiàn)為NR最高,這說(shuō)明將根系去除后,土壤資源的質(zhì)量和多樣性反而升高。碳源輸入方式的變化并沒(méi)有改變土壤中有機(jī)質(zhì)的分解途徑,在各處理中,線蟲通路比值(NCR)均大于0.5,表明土壤食物網(wǎng)仍是為以細(xì)菌為基礎(chǔ)的分解通道占優(yōu)勢(shì)。

表4 不同碳源輸入方式下土壤線蟲生態(tài)指數(shù)Table 4 Ecological index of soil nematodes under different carbon source input methods

2.3 土壤線蟲β多樣性分析

主坐標(biāo)分析(Principal Coordinates analysis,PCoA)用于衡量不同碳源輸入方式下土壤線蟲群落物種組成的相似度,進(jìn)而明確各樣本之間在群落物種結(jié)構(gòu)上的差異性。ANOSIM(Analysis of similarities)分析結(jié)果表明,各樣地之間土壤的OTU組成之間存在極顯著差異(R=0.296,P=0.006)。

對(duì)各樣地?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA),如圖4所示,PC1和PC2分別解釋變量方差的13.23%和12.38%,兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)25.38%。PC1 將NL中的土壤線蟲群落與NR明顯區(qū)分開(kāi)。通過(guò)分析各樣本之間的距離來(lái)推測(cè)相似和差異情況,其距離越遠(yuǎn),說(shuō)明線蟲群落差異越大。總體而言,CK,NL,NR樣地的土壤線蟲群落各樣本組內(nèi)聚集明顯,且組間距離較遠(yuǎn),各碳源輸入處理之間土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖4 不同碳源輸入方式下土壤OTU的主成分分析 Fig.4 Principal component analysis of soil OTU under different carbon source input methods

2.4 土壤線蟲群落與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系

土壤提供了線蟲生長(zhǎng)繁殖的微環(huán)境,而不同碳源輸入方式使得土壤理化性質(zhì)在一定程度上發(fā)生改變,這也進(jìn)一步會(huì)對(duì)土壤線蟲群落產(chǎn)生影響。為探究環(huán)境變量與線蟲群落組成之間的關(guān)系,本文基于常見(jiàn)線蟲屬與土壤環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析(RDA)(圖5)。第一、二軸解釋的變量為44.86%以及29.30%。在圖3中可以觀察到TC,TN與異色矛屬(Achromadora)以及桿咽屬(Rhabdolaimus)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。pH和三裂體屬(Trischistoma)呈正相關(guān)(P>0.05),和棱咽屬(Prismatolaimus)呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)。SM和三裂體屬(Trischistoma),皮桿亞屬(Choriorhabditis)呈正相關(guān)(P>0.05)。銨態(tài)氮與棱咽屬(Prismatolaimus)呈正相關(guān)(P>0.05),與三裂體屬(Trischistoma)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。硝態(tài)氮與似雙胃屬(Diplogasteroides),銼齒屬(Mylonchulus)呈正相關(guān)(P>0.05)。

圖5 常見(jiàn)線蟲屬與土壤環(huán)境因子冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of common nematodes and soil environmental factorsTN：全氮Total N；TC：全碳Total C；SM：含水量Soil moisture

3 討論

3.1 碳源輸入方式對(duì)土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)的影響

不同碳源輸入方式通過(guò)控制輸入碳源的數(shù)量和質(zhì)量來(lái)改變土壤環(huán)境,間接影響土壤線蟲群落組成與結(jié)構(gòu)。本研究中,僅凋落物輸入處理使得屬于食細(xì)菌線蟲的桿咽屬(Rhabdolaimus)和無(wú)咽屬(Alaimus)的相對(duì)豐度的大幅增加(圖2)。此外,TN與桿咽屬(Rhabdolaimus)呈顯著正相關(guān)(圖5)。李成一等[26]研究指出,在一定的閾值范圍內(nèi),氮含量的提升對(duì)細(xì)菌生物量有直接的積極作用。桿咽屬(Rhabdolaimus)等在僅凋落物輸入處理中相對(duì)豐度大幅增加,原因可能是氮含量增加所致。去除根系使得植物不能吸收土壤中的有效氮[27],導(dǎo)致土壤中一部分氮被保留。同時(shí),根系去除后由于易變性碳源減少,使得微生物量下降,釋放了一部分被固定的氮,進(jìn)而導(dǎo)致土壤中全氮量增加[28](表1)。而氮元素的提高增加了細(xì)菌生物量,進(jìn)而刺激了該線蟲大量繁殖。由此可見(jiàn),TN是影響線蟲群落組成的重要因子。本研究還發(fā)現(xiàn),相比于凋落物和根系同時(shí)輸入以及僅凋落物輸入處理,僅根系輸入處理中屬于食細(xì)菌線蟲的棱咽屬(Prismatolaimus)比例大幅提升(圖2),成為該樣地中的優(yōu)勢(shì)屬,同時(shí)其與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)(圖5)。Li等[29]研究指出,土壤pH值越高,食細(xì)菌線蟲的比例反而越低。土壤pH值由土壤中陰陽(yáng)離子決定,植物生長(zhǎng)時(shí),土壤中的陽(yáng)離子被吸收,最后以落葉的形式重返土壤。Fujii等[30]認(rèn)為,將凋落物移除后,沒(méi)能使陽(yáng)離子進(jìn)入地下,造成陰陽(yáng)離子失衡,土壤pH值降低。因此,本研究推測(cè)棱咽屬(Prismatolaimus)相對(duì)豐度的增加可能是僅根系輸入處理將凋落物移除引起的土壤pH值下降所致。

進(jìn)一步對(duì)土壤線蟲群落的營(yíng)養(yǎng)類群進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明,不同碳源輸入處理下CK；NL；NR；NLR)的食細(xì)菌線蟲的相對(duì)豐度在各營(yíng)養(yǎng)類群中均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(圖3)。焦向麗等[31]對(duì)東北地區(qū)不同林型土壤線蟲群落研究表明,天然次生林中食細(xì)菌線蟲數(shù)量最大,且組成最豐富,這與本文研究結(jié)果一致。根系釋放的分泌物如碳水化合物、氨基酸等容易降解,主要在細(xì)菌能量通道中代謝,更多的刺激細(xì)菌和以細(xì)菌為食的線蟲種群[29]。因此,本研究推測(cè)在僅凋落物輸入處理中,將根系去除會(huì)使得食細(xì)菌線蟲的相對(duì)豐度降低。然而,與假設(shè)相反,本研究發(fā)現(xiàn)去除根系后食細(xì)菌線蟲的相對(duì)豐度卻大大增加(圖3)。根系分泌物等雖然為土壤動(dòng)物群落提供了碳源,但根系對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收也會(huì)與土壤細(xì)菌爭(zhēng)奪養(yǎng)分[32]。由此可見(jiàn),雖然去除根系阻止了光合產(chǎn)物從地上植物進(jìn)入土壤,但是由于減少了土壤對(duì)植物所需碳源的輸出,益于土壤中碳源的保留,反而豐富了食細(xì)菌線蟲的食物來(lái)源。與食細(xì)菌線蟲的變化不同,僅凋落物輸入處理顯著降低了食真菌線蟲的相對(duì)豐度(圖3)。Subke等[33]認(rèn)為,去除根系抑制了樹(shù)木和土壤之間的能量聯(lián)系,并對(duì)菌根真菌產(chǎn)生負(fù)面影響,進(jìn)而導(dǎo)致了真菌生物量的下降。因而,本研究推測(cè)將根系去除后,食真菌線蟲的比例顯著降低可能和菌根真菌的減少有關(guān)。此外,雖然僅根系輸入處理在一定程度上影響著線蟲群落營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu),但是和僅凋落物輸入處理相比,變化程度較小,且均不顯著,這表明地下碳輸入對(duì)土壤線蟲的影響可能比地上碳輸入更為重要[34]。Keith等[35]指出,根的輸入可能是形成土壤食物網(wǎng)中營(yíng)養(yǎng)成分的核心,地下碳源輸入對(duì)土壤線蟲的結(jié)構(gòu)和復(fù)雜性的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于凋落物。另一方面,根際的基質(zhì)容易降解,而凋落物的分解更加緩慢[36],而本實(shí)驗(yàn)周期較短,可能是導(dǎo)致變化不顯著的另外一個(gè)原因。

3.2 碳源輸入方式對(duì)土壤線蟲群落生態(tài)指數(shù)的影響

物種多樣性是維持生態(tài)系統(tǒng)正常功能的前提,土壤動(dòng)物的多樣性體現(xiàn)著土壤微食物網(wǎng)的復(fù)雜性和健康程度。本研究發(fā)現(xiàn),與其他碳源輸入方式相比,無(wú)碳源輸入處理的多樣性指數(shù)(H′)最低,且優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(Dom)最高(表4),說(shuō)明去除凋落物和根系使得土壤線蟲群落的多樣性下降,物種組成比例更加不均衡,這與本文的假設(shè)相一致。食物資源是影響土壤線蟲群落多樣性的重要因素之一[37]。在森林生態(tài)系統(tǒng)中,植物活根將碳源轉(zhuǎn)移到根際土壤[38],植物凋落物也是土壤碳的主要來(lái)源[39]。與凋落物和根系同時(shí)輸入相比,無(wú)碳源輸入處理顯著降低了土壤中的全碳(TC)的含量(表1),這也改變了土壤微生物的食物數(shù)量和質(zhì)量[40],以微生物為食的的線蟲必然也會(huì)因食物減少而受到影響。另外,去除凋落物后,由于不能抵擋紫外線的照射,也會(huì)影響土壤線蟲的生長(zhǎng)和繁殖[35]。因此,食物資源得減少以及庇護(hù)所的缺失可能是土壤線蟲群落多樣性下降的主要原因。帽兒山地區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候,具有明顯的季節(jié)變化。該地春季土壤的反復(fù)凍融是常見(jiàn)的溫度變化現(xiàn)象,凍融作用通過(guò)改變土壤結(jié)構(gòu)和土壤水熱狀況間接影響土壤生物的結(jié)構(gòu)和活性[41]。將本次凍融期線蟲群落生態(tài)指數(shù)數(shù)據(jù)和之前7月份生長(zhǎng)期的土壤樣品的數(shù)據(jù)相比較(數(shù)據(jù)未發(fā)表),發(fā)現(xiàn)3月份凍融期的多樣性指數(shù)(H′)明顯低于生長(zhǎng)期。生長(zhǎng)期水分和熱量條件較好,更利于微生物分解有機(jī)質(zhì),并且土壤生物數(shù)量和種類較多,線蟲食物資源也更為豐富[42]。而反復(fù)凍融破壞土壤團(tuán)聚體,導(dǎo)致土壤中的微生物死亡,減少了微生物的多樣性[43],造成了土壤線蟲的食物來(lái)源的數(shù)量和種類減少,進(jìn)而降低了土壤線蟲的多樣性。此外,三月份凍融期的線蟲群落生態(tài)指標(biāo)是運(yùn)用高通量測(cè)序數(shù)據(jù)計(jì)算得到的,而生長(zhǎng)期的生態(tài)指數(shù)是通過(guò)原始的形態(tài)學(xué)鑒定數(shù)據(jù)計(jì)算得到的。因而,數(shù)據(jù)獲取方式的差異也可能是造成二者季節(jié)間差異的原因,這也有待于進(jìn)一步探索和研究。

MI指數(shù)越低,表明土壤受到的干擾越嚴(yán)重,MI指數(shù)越高,表明土壤養(yǎng)分越富集,土壤環(huán)境越穩(wěn)定[44]。有研究指出[35]與僅凋落物輸入相比,根的存在可能會(huì)進(jìn)一步改善土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu),這和本研究結(jié)果相反。本研究發(fā)現(xiàn),僅凋落物輸入處理的線蟲成熟度指數(shù)(MI)最高(表4)。一般認(rèn)為,捕食雜食線蟲是決定食物網(wǎng)復(fù)雜性的關(guān)鍵類群。本研究發(fā)現(xiàn)在僅凋落物輸入處理中,捕食雜食線蟲的相對(duì)豐度最高,這可能是由于將根系去除后,植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取的減少[28],保留了土壤中的碳氮含量,增加了線蟲所需的食物質(zhì)量,進(jìn)而提高了土壤中線蟲群落的多樣性(表4)。而豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和多樣的物種為捕食雜食線蟲提供了較好的生存環(huán)境,益于其生存和繁殖,進(jìn)而提高了線蟲成熟度指數(shù)(MI)。較高的線蟲成熟度指數(shù)(MI)也反映出NR中土壤食物網(wǎng)的營(yíng)養(yǎng)層次增加,食物網(wǎng)更加穩(wěn)定。各處理間線蟲通路比值(NCR)均大于0.5(表4),這表明土壤食物網(wǎng)的分解通道仍是以細(xì)菌占優(yōu)勢(shì),營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化效率較高,分解代謝過(guò)程均較快。有研究指出,細(xì)菌與其他微生物相比,對(duì)抗土壤凍融循環(huán)的抵抗能力更強(qiáng)[45],推測(cè)這可能是凍融期細(xì)菌途徑分解土壤有機(jī)物質(zhì)更加占優(yōu)勢(shì)的重要原因之一。

本研究中,線蟲群落生態(tài)指標(biāo)的結(jié)果均是將未分類線蟲屬排除后計(jì)算得到的。基于已測(cè)得的68個(gè)線蟲屬進(jìn)行生態(tài)指標(biāo)計(jì)算,用以反映已確定線蟲群落對(duì)不同碳源輸入處理的響應(yīng)。但是,數(shù)據(jù)中大量的未分類線蟲屬必然會(huì)在一定程度上影響生態(tài)指標(biāo)的結(jié)果,這也是目前高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于線蟲群落研究存在的缺點(diǎn),是今后進(jìn)一步改正和發(fā)展的方向。本文為高通量測(cè)序技術(shù)在線蟲群落方面的研究提供了數(shù)據(jù)支持。此外,本研究可以檢測(cè)到不同碳源輸入處理引起的土壤線蟲群落組成以及群落生態(tài)指標(biāo)的變化,但由于實(shí)驗(yàn)周期較短,部分變化不是很顯著。在森林生態(tài)系統(tǒng)中,特別是較少受人類干擾的森林生態(tài)系統(tǒng),土壤食物資源富足,因此短時(shí)間內(nèi)碳源輸入方式變化對(duì)土壤微食物網(wǎng)影響相對(duì)較小[46]。這也需要今后繼續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展連續(xù)的動(dòng)態(tài)的野外控制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其間的內(nèi)在聯(lián)系。

4 結(jié)論

不同碳源輸入處理之間的土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)差異顯著,說(shuō)明碳源輸入變化調(diào)節(jié)著土壤線蟲群落。同時(shí),僅凋落物輸入處理比僅根系輸入處理對(duì)土壤線蟲群落的影響更明顯。和本文假設(shè)一致的是,僅凋落物輸入處理降低了食真菌線蟲的相對(duì)豐度。無(wú)碳源輸入處理使得土壤線蟲的群落多樣性下降,生態(tài)環(huán)境質(zhì)量變差。這也說(shuō)明重視森林生態(tài)系統(tǒng)中植被保護(hù)的重要性。同時(shí),僅凋落物輸入處理的捕食雜食線蟲相對(duì)豐度最大,線蟲成熟度指數(shù)(MI)最高。不同碳源輸入處理下土壤食物網(wǎng)有機(jī)質(zhì)分解均以細(xì)菌降解途徑占主導(dǎo)。由于實(shí)驗(yàn)周期較短,部分碳源輸入方式處理之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異不明顯,因此還需要長(zhǎng)期的觀測(cè),進(jìn)一步深入探討土壤環(huán)境變化與土壤線蟲的適應(yīng)過(guò)程。本研究利用的高通量測(cè)序技術(shù)可以對(duì)線蟲進(jìn)行快速評(píng)估,在方法上對(duì)線蟲群落的研究提供了有力支持。但是,目前該技術(shù)存在的弊端,如序列注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完善,以及引物位點(diǎn)的序列不匹配等,亟待解決。盡管高通量測(cè)序技術(shù)存在局限性,但是由于它具有比形態(tài)分析提供更高的分類分辨率的潛力,必然有助于加快土壤線蟲群落的研究進(jìn)程。