精神分裂癥患者腸道菌群多態(tài)性與代謝產物的關系*

余卓恒，宋文剛，梁靜文

1.廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518116；2.北華大學醫(yī)學部，吉林吉林 132000

精神分裂癥是困擾現代人類的重大慢性精神疾病之一，主要在青春期發(fā)作，持續(xù)終生。它干擾了患者多方面的生活，其復雜的病因和發(fā)病機制使大部分患者的臨床療效并不明顯，同時也給社會和家庭造成嚴重的負擔[1-2]。近年研究發(fā)現，腸道菌群失調是精神類疾病發(fā)病的重要影響因素[3]，腸道微生物可通過微生物-腸-腦軸影響神經遞質的分泌，從而影響神經發(fā)育、認知和行為，而且通過神經內分泌可調節(jié)多種神經遞質參與精神疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。目前，國內外關于精神分裂癥與腸道菌群方面的研究并不多。本研究擬收集精神分裂癥患者和體檢健康者的糞便標本，進行16S rRNA高通量測序，并采用液相色譜-質譜(LC-MC)非靶向代謝組學方法檢測精神分裂癥患者和體檢健康者糞便標本代謝產物，分析精神分裂癥患者腸道菌群結構及其代謝產物變化，尋找腸道菌群改變影響精神分裂癥患者代謝產物的相關機制，并尋找特征性指標協助臨床診斷精神分裂癥。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年5-11月在深圳市龍崗中心醫(yī)院收治住院的21例精神分裂癥患者的糞便標本作為精神分裂癥組，其中男11例，女10例；年齡21～71歲，平均(44.48±5.39)歲。精神分裂癥患者納入標準：(1)符合精神分裂癥相關診斷標準，由兩名精神科醫(yī)生(至少1名醫(yī)生為副主任醫(yī)師以上職稱)診斷一致；(2)患者疾病史均在1年以上，服用藥物種類相對一致且病情相對穩(wěn)定。排除標準：(1)患者合并有糖尿病、甲狀腺疾病、高血壓、心臟病等其他可能影響腸道菌群穩(wěn)定性的疾病；(2)近3個月內有腹瀉癥狀者；(3)近3個月內使用過抗菌藥物或益生菌類藥物治療者；(4)妊娠、哺乳期或月經期女性。選擇同期在該院進行體檢的21例體檢健康者的糞便標本作為健康對照組，其中男11例，女10例，年齡23～68歲，平均(43.52±4.27)歲。納入標準：(1)由1名精神科醫(yī)師單獨進行訪談并排除精神類疾病；(2)無精神病家族史；(3)未服用與精神病相關的任何藥物；(4)年齡、性別分別與患者匹配。健康對照組的排除標準同精神分裂癥組。

1.2方法 本研究采用16S rRNA高通量測序檢測精神分裂癥組和健康對照組的腸道菌群差異，并采用LC-MC非靶向代謝組學方法檢測精神分裂癥組和健康對照組其中17例糞便標本的代謝產物，分析精神分裂癥患者腸道菌群結構及其代謝產物變化。所取得的糞便標本均在完成留樣后2 h內采用無菌小離心管進行分裝，并于-70 ℃低溫冰箱冷凍保存。

1.2.1Alpha多樣性分析 選擇Alpha多樣性指數對標本中的菌群豐度和多樣性進行分析，分別使用Shannon指數評估標本的菌群多樣性和chao1指數評估菌群豐度(物種的種類數量)，將得到的2個指數利用Wilcox Test統計方法分析精神分裂癥組和健康對照組間的Alpha多樣性指數差異。

1.2.2Beta多樣性分析 本研究同時選擇Weighted Unifrac距離，Unweighted Unifrac距離及Bray Curtis距離這3個距離模型作為Beta多樣性距離的參考指標，評估不同樣品及分組間的微生物群落結構差異，采用無度量多維標定法統計分析。

1.2.3腸道菌群結構差異 選取在屬分類相對水平豐度排名前20的物種，分析各標本和各分組在屬水平上的相對分布情況。采用LEFSe方法分析組間可操作分類單元(OUT)差異，選擇LDA值>2作為篩選標準，即具有統計學意義的Biomakers特征微生物。

1.2.4非靶向代謝組學分析 將所有代謝物用KEGG數據庫br08001進行注釋，得到代謝物所扮演的生物學角色，然后統計每個生物學角色的百分比，繪制百分比堆積柱形圖。

1.3統計學處理 采用16S rRNA測序得到全部原始序列進行質量控制、去噪、拼接、去嵌合體，形成OUT，即特征序列。采用LEFSe(基于物種相對豐度)和DESeq2(基于物種比例)進行標本的物種組間差異性分析；采用Wilcox Test統計方法對Alpha多樣性進行組間差異性分析；采用PERMANOVA統計方法對Beta多樣性進行組間差異性分析。測序分析流程基于qiime2及R語言數據包，以P<0.05為差異有統計學意義。

LC-MC非靶向代謝組實驗數據先標準化處理使得所有的代謝物水平的中位數和上下四分位點基本處于同一水平；采用log轉化使得代謝物水平分布接近正態(tài)分布；采用正交偏最小二乘別分析(OPLS-DA)模型和雙樣本t檢驗進行組間差異分析。所有分析流程基于R語言數據包，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1精神分裂癥組與健康對照組糞便標本腸道微生物多樣性分析

2.1.1Alpha多樣性分析 結果顯示，兩組間的Alpha多樣性差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.1.2Beta多樣性分析 Beta多樣性分析結果顯示，標本分布在組間和組內間有差異。結合PERMANOVA統計方法再次進行分析所得的Bray Curtis Distance、Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離的P均<0.05，即兩組間的Beta多樣性有明顯差異，組間菌群結構有明顯差異，見圖2～4。

注：A為Shannon指數分析結果圖；B為chao指數分析結果圖。圖1 Alpha多樣性分析結果圖

圖2 Bray Curtis距離分析圖

圖4 Unweighted Unifrac距離矩陣分析圖

2.2精神分裂癥組與健康對照組在屬水平上腸道菌群結構差異 根據屬水平上物種的相對分布情況顯示各標本和各分組間均有差異，見圖5。篩選到19個屬水平上的差異性大的物種，再結合DESeq2方法統計屬水平上物種的P<0.05的菌屬，其中上調菌屬有12個：安德克菌屬、消化鏈球菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、錐形桿菌屬、普雷沃菌屬、梭桿菌屬、醋酸桿菌屬、疣微菌屬、瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬、優(yōu)桿菌；下調的菌屬有7個：糞桿菌屬、嗜血菌屬、毛螺菌屬、德克斯菌屬、假丁酸弧菌屬、SMB53、氨基酸球菌屬。

圖5 兩組在屬水平上的腸道菌群結構差異

2.3LC-MC非靶向代謝組學分析結果

2.3.1兩組代謝物組成的差異分析 結果顯示，兩組間的代謝物的組成存在不同程度的差異。見圖6。

圖6 精神分裂癥組和健康對照組糞便標本中代謝物組成的差異分析

2.3.2兩組糞便標本的特征代謝物篩選 本研究在OPLS-DA的置換檢驗中，使用Q2作為檢驗統計量，使用置換的方法求得Q2的隨機分布，并計算其P值以求證明其預測能力，P均<0.01，說明該預測模型能區(qū)分兩組之間代謝物的差異，見圖7。本研究利用OPLS-DA模型的判別分析尋找VIP(重要性)最大的代謝物，選擇 VIP>1并且經 FDR校正后的P<0.05的代謝物，本研究找到了7個代謝物分別為：異丙腎上腺素、R-3-羥基肉豆蔻酸、13-二甲基尿酸、137-三甲基尿酸、十一酸、鵝去氧膽酸、鄰氨基苯甲酸。最后結合OPL-DA模型篩選VIP最大的代謝物和單變量分析，發(fā)現異丙腎上腺素、R-3-羥基肉豆蔻酸、十一酸、鵝去氧膽酸、鄰氨基苯甲酸在精神分裂癥組中是上調的，而13-二甲基尿酸、137-三甲基尿酸在精神分裂癥組中是下調的。

注：A為陽離子模式的Q2分布圖；B為陰離子模式的Q2分布圖。圖7 兩組在OPLS-DA檢驗中Q2分布圖

2.3.3多組學關聯的相關性分析 本研究對屬水平上的微生物及負離子的代謝物同時進行雙樣本t檢驗，得到相關的差異物種及差異代謝物(P<0.05)，根據本研究找到的特征菌屬和特征代謝物進行關聯性熱圖分析發(fā)現，精神分裂癥患者中可能與脂肪酸代謝途徑正向調節(jié)相關的菌屬有梭菌屬、消化鏈球菌屬、梭桿菌屬、腸球菌屬，負向調節(jié)相關的菌屬有假丁酸弧菌屬、糞桿菌屬；與鵝去氧膽酸正向調節(jié)相關的菌屬有梭菌屬、消化鏈球菌屬、腸球菌屬、優(yōu)桿菌屬，負向調節(jié)相關的菌屬有糞桿菌屬、假丁酸弧菌屬、嗜血菌屬、毛螺旋菌屬；與免疫炎癥機制正向調節(jié)相關的菌屬有腸球菌屬、消化鏈球菌、梭桿菌屬、疣微菌屬、優(yōu)桿菌屬，負向調節(jié)相關的有毛螺旋菌屬、氨基酸球菌屬。

3 討 論

本研究收集21例精神分裂癥患者和21例體檢健康者的糞便進行16S rRNA測序，并采用LC-MC非靶向代謝組學檢測精神分裂癥患者和體檢健康者中的17例糞便標本的代謝產物。因考慮標本對菌群結構的影響因素較多，本研究對精神分裂癥組和健康對照組的年齡跟性別進行一一配對。研究采用Alpha多樣性分析發(fā)現精神分裂癥組和健康對照組間微生物菌群數量沒有明顯的差異，可能因精神分裂癥組經藥物治療后，導致菌群數量接近健康對照組菌群數量水平。但采用Beta多樣性分析，患者腸道微生物構成有明顯差異，差異有統計學意義的共有19個，而且還發(fā)現疣微菌和梭桿菌是從門水平到屬水平在精神分裂癥患者中顯著富集。

在屬水平上，與健康對照組比較，精神分裂癥組7個菌屬相對豐度降低，12個菌屬相對豐度升高，其中2個屬于典型的益生菌(毛螺菌屬和糞桿菌)屬水平較低。毛螺菌屬能參與人體短鏈脂肪酸的代謝，而短鏈脂肪酸是腸上皮細胞能量的主要來源[5]，因此毛螺菌屬水平降低可能會導致腸上皮細胞通透性改變，進而導致短鏈脂肪酸進入血液循環(huán)并通過血腦屏障直接影響中樞神經系統，誘發(fā)神經系統炎癥并引發(fā)與精神分裂癥相關的行為特征。

本研究發(fā)現精神分裂癥組的普雷沃菌屬、疣微菌屬、瘤胃球菌屬明顯高于健康對照組，而嗜血桿菌和德克斯菌屬則減少，與相關研究一致[3,6-8]。SCHWARZ等[7]還報道瘤胃球菌屬水平增加與精神分裂癥的陰性癥狀和認知缺陷的減少相關，乳酸菌的豐度在精神分裂癥患者首發(fā)時增加，并且與癥狀的嚴重程度呈正相關，但是本研究中乳酸桿菌在精神分裂癥組和健康對照組間的差異不明顯，可能是因為本研究的精神分裂癥組有藥物使用情況。本研究發(fā)現精神分裂癥組的腸道菌群組成確實發(fā)生了明顯的變化，這些變化的菌群可能與精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展有一定的關聯，有望為精神分裂癥早期診斷及治療提供一定的依據。

精神分裂癥患者存在認知功能障礙，其大腦的認知功能進化與能量代謝相關[9]。腸道微生物不僅參與人體內腸道代謝，其產生的代謝產物也能影響機體不同的代謝途徑，進而影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現137-三甲基尿酸、13-二甲基尿酸在精神分裂癥組中是下調的，其中甲基尿酸為嘌呤類生物堿。一些嘌呤類生物堿能促進脂肪酸β氧化及增強氧化磷酸化，同時增強機體組織脂肪燃燒，達到降血脂的作用[10]。精神分裂癥組腸道微生物代謝物甲基尿酸的下調可能致使脂肪代謝減少，進一步導致脂肪酸增加，這可能是精神分裂癥組引起代謝產物飽和脂肪酸十一酸上調的原因。據本研究找到的特征菌屬和特征代謝物進行關聯性熱圖分析發(fā)現，精神分裂癥患者中可能與脂肪酸代謝途徑正向調節(jié)相關的菌屬有梭菌屬、消化鏈球菌屬、梭桿菌屬、腸球菌屬，負向調節(jié)相關的菌屬有假丁酸弧菌屬、糞桿菌屬。

本研究發(fā)現精神分裂癥組的腸道菌群代謝產物鵝去氧膽酸水平較健康對照組升高，鵝去氧膽酸由肝臟合成，分泌到腸道，經細菌生物轉化形成次級膽汁酸包括脫氧膽酸和膽石酸。膽汁酸信號通路核受體法尼酯X受體(FXR)與TakedaG蛋白偶聯受體5已被鑒定為胰島素抵抗、肥胖、脂質代謝和全身代謝過程的調節(jié)劑[11]，其中鵝去氧膽酸激活FXR的能力最強。有研究顯示，長期使用氯氮平治療可引起患者脂代謝異常，導致不可逆的肥胖[12]。本研究中精神分裂癥患者均接受過氯氮平等精神分裂癥常用的藥物治療，且鵝去氧膽酸水平較體檢健康者升高，有可能激活FXR，引起脂質代謝異常。在特征菌屬和特征代謝物的關聯性熱圖中發(fā)現，與鵝去氧膽酸正向調節(jié)相關的菌屬有梭菌屬、消化鏈球菌屬、腸球菌屬、優(yōu)桿菌屬，負向調節(jié)相關的菌屬有糞桿菌屬、假丁酸弧菌屬、嗜血菌屬、毛螺旋菌屬。

有研究表明，高飽和脂肪飲食增加革蘭陰性菌的比例，進而增加內毒素血癥[13]。同時，NGUYEN等[14]研究了不同膳食油處理對豬回腸組織體外內毒素轉運的影響，發(fā)現魚肝油和魚油(不飽和脂肪)降低了腸道通透性，而椰子油(飽和脂肪)增加腸道通透性。脂筏可調節(jié)腸內毒素轉運，飽和脂肪可穩(wěn)定脂筏，使內毒素轉運更充分，揭示飽和脂肪可能通過增加腸道滲透性，改變腸道菌群組成，從而導致代謝性內毒素血癥[14]。另外脂質A可與巨噬細胞上的Toll樣受體4(TLR4)結合引起機體的免疫和炎癥反應[15]。R構型的3-羥基豆蔻酸是天然的脂質A的組成成分，而脂質A是內毒素的主要組成結構，本研究發(fā)現的特征菌屬大部分為革蘭陰性菌，這可能就是R-3-羥基肉豆蔻酸上調的原因；另外鄰氨基苯甲酸是一種具有毒性的物質，對黏膜有刺激作用，這2個代謝物的上調可能通過增加腸道滲透性引發(fā)細菌移位和炎癥反應。在特征菌屬和特征代謝物的關聯性熱圖中發(fā)現，與免疫炎癥機制正向調節(jié)相關的菌屬有腸球菌屬、消化鏈球菌、梭桿菌屬、疣微菌屬、優(yōu)桿菌屬，負向調節(jié)相關的有毛螺旋菌屬、氨基酸球菌屬。

精神分裂癥患者可通過酪氨酸代謝途徑分解酪氨酸合成兒茶酚胺類代謝物，進而影響疾病的進程[16-17]。本研究發(fā)現異丙腎上腺素的在精神分裂癥患者中是上調的，也符合這一論點。腎上腺素主要通過酪氨酸代謝產生，但是異丙腎上腺素不是天然存在的腎上腺素，異丙腎上腺素主要通過肝臟代謝并由腎臟進行排泄，而且半衰期短，本研究在腸道檢測出有較高水平的異丙腎上腺素，這是否提示腸道菌群可以通過酪氨酸代謝合成異丙腎上腺素，這有待進一步研究驗證。

本研究分析精神分裂癥患者和體檢健康者間的腸道微生物結構及其腸道微生物代謝產物的差異，為精神分裂癥的臨床診斷和治療道路上提供一定證據。但也存在以下問題：患者樣本量少、受糞便標本保存及運送條件等影響較大。本研究中患者入組時已接受藥物治療，無法分析治療前的腸道微生物的結構組成，不能明確精神分裂癥治療常用藥物對腸道菌群的影響。后續(xù)研究需擴大患者樣本量，控制其他外在干擾因素進行縱向深入研究，納入未經治療的研究對象，研究用藥前后患者腸道菌群變化情況。