粘質沙雷氏菌對重金屬的耐受性和去除作用*

王 城，王玉潔,劉榮枝，薛常魯

(嘉興學院生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001)

重金屬具有毒性、非生物降解性、持久性和生物累積性，當其超過環境最大處理容量時，是一種對生態環境和人體健康危害極大的污染物[1-2]。浙江省以印染、皮革等行業為支柱產業，印染和皮革廢水中重金屬含量嚴重超標，是環境保護規劃和整治的重點對象。

治理重金屬污染的方法有：物理修復法(包括吸附法、液膜法、電滲析法等)、化學修復法(包括化學沉淀法、氧化還原法、離子交換法等)、生物修復法等[3]。傳統的物理和化學修復法存在著成本大、能耗高、二次污染等不足[3-4]。生物修復法自20世紀90年代以來，因為其投資小、運行費用低、對環境友好等優點而備受關注[5]。微生物修復相對于其他生物，具有實施方便、高效、資源豐富等優點，成為環境重金屬污染修復新技術探索中的熱點之一[4-5]。陳亞奎等[6]發現粘質沙雷氏菌HB-4對水體中Cd2+具有高吸附性和高耐受性，該菌株能在 Cd2+濃度為 300 mg/L時正常生長，對 Cd2+的去除率達到50%以上。李同靈等[7]篩選出一株埃希氏菌P15菌株最高耐Pb濃度達1200 mg/L。

目前利用微生物進行重金屬修復的主要集中菌種資源的開發[7,9-10]和對重金屬污染治理條件及機制[6,8,11-14]的實驗室探索階段。本課題組獲得一株高產靈菌紅素的粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescensjx-1)，在前期研究的基礎上已發現該菌具有良好的抑菌、抑藻生物活性[16-17]。本研究旨在探討該菌株對Cu2+、Zn2+、Cr6+三種重金屬的耐受性和去除效果，從而為開發高效節能的微生物重金屬治理方法提供基礎。

1 實驗材料

1.1 菌 種

粘質沙雷氏菌 (Serratiamarcescensjx-1)，實驗室保藏。

1.2 試 劑

銅標準液(1 mg/mL)，鋅標準液(1 mg/mL)，鉻標準液(1 mg/mL)，CuSO4·5H2O(AR)，ZnSO4·7H2O(AR)，K2Cr2O7(AR)。

1.3 培養基

LB培養基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，pH 7.2。

液體培養基：蛋白胨13 g/L，甘油20 g/L，MgSO41.2 g/L，NaCl 5.0 g/L，甘氨酸2.0 g/L，pH 7.2。

1.4 儀 器

710-ES電感耦合等離子發射光譜儀，Varian公司；UV-1801紫外分光光度計，北分瑞利公司；VS-130超凈臺，蘇州安泰；HD-930恒溫震蕩培養箱，上海隆拓儀器設備有限公司。

2 實驗方法

2.1 菌種活化

將從-70 ℃保存的菌種轉接于LB平板上培養12 h，挑選單菌落接種于液體LB培養基，37 ℃、200 rpm/min培養12 h獲得種子液，控制種子液密度在OD600為0.8左右。

2.2 S.marcescens jx-1對重金屬Cu2+的耐受性研究

配置5 g/L的CuSO4母液，調節液體發酵培養基中Cu2+的濃度梯度為0、50、100、150、200 mg/L，接種后分別在37 ℃和28 ℃下，200 r/min培養60 h，每隔12 h取樣測OD600，考察S.marcescensjx-1在不產靈菌紅素(37 ℃培養)和產靈菌紅素時(28 ℃培養)對不同濃度重金屬Cu2+的耐受性。

(1)

2.3 S.marcescens jx-1對重金屬Zn2+的耐受性研究

配置5 g/L的ZnSO4母液，設置發酵液中Zn2+濃度梯度為0、50、100、150、200 mg/L，按照2.2實驗方法考察S.marcescensjx-1對重金屬Zn2+的耐受性。

2.4 S.marcescens jx-1對單一重金屬的耐受性研究

配置5 g/L的K2Cr2O7母液，設置發酵液中Zn2+濃度梯度為0、50、100、150、200 mg/L，按照2.2實驗方法考察S.marcescensjx-1對重金屬Cr6+的耐受性。

2.5 S.marcescens jx-1對重金屬的去除作用

根據2.2、2.3和2.4的實驗結果，設置液體培養基中Zn2+、Cu2+、Cr6+的濃度分別為250 mg/L、100 mg/L、100 mg/L，接種后在28 ℃，200 r/min培養60 h，每隔12 h取樣，經離心過濾后電感耦合等離子發射光譜方法測定重金屬的含量，計算重金屬的去除率，考察S.marcescensjx-1對不同重金屬的去除效果。

去除率 =(C0-Ce)/C0×100%

(2)

式中：C0為空白組的重金屬含量；Ce為實驗組的重金屬含量。

3 結果與討論

3.1 S.marcescens jx-1對重金屬Cu2+的耐受性

根據2.2實驗方法，分別考察37 ℃(不產靈菌紅素)和28 ℃(產靈菌紅素)條件下，不同濃度的Cu2+對S.marcescensjx-1生長的影響，結果如圖1和圖2所示。

圖1 37 ℃時Cu2+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.1 The effect of Cu2+ to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

圖2 28 ℃時Cu2+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.2 The effect of Cu2+ to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由圖1可知，在37 ℃振蕩培養時，S.marcescensjx-1不產生靈菌紅素，菌體產量較低，Cu2+為50 mg/L時對菌體有明顯抑制，培養24 h時抑制率為43.3%，Cu2+為150 mg/L時表現出基本完全抑制，S.marcescensjx-1對Cu2+最高耐受濃度為100～150 mg/L。由圖2可知，在28 ℃振蕩培養時，S.marcescensjx-1產生靈菌紅素，菌體產量較高，Cu2+為50 mg/L時基本沒明顯抑制，培養24 h時抑制率僅為2.6%，Cu2+為100 mg/L時對菌體有明顯抑制，培養24 h時抑制率為63.4%，Cu2+為200 mg/L時表現出完全抑制，S.marcescensjx-1對Cu2+最高耐受濃度為150～200 mg/L。

3.2 S.marcescens jx-1對重金屬Zn2+的耐受性

根據2.3實驗方法，分別考察37 ℃(不產靈菌紅素)和28 ℃(產靈菌紅素)條件下，不同濃度的Zn2+對S.marcescensjx-1生長的影響，結果如圖3和圖4所示。

圖3 37 ℃時Zn2+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.3 The effect of Zn2+to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

圖4 28 ℃時Zn2+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.4 The effect of Zn2+to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由圖3可知，不產生靈菌紅素，在0～100 mg/L范圍內，Zn2+對菌體生長無明顯影響；Zn2+在150 mg/L時對菌體有明顯抑制，培養24 h時抑制率為53%，250 mg/L時接近完全抑制，S.marcescensjx-1對Zn2+最高耐受濃度為200～250 mg/L。由圖4可知，產生靈菌紅素時，在0～100 mg/L范圍內，培養24 h時Zn2+對菌體生長有一定促進作用；Zn2+為100～250 mg/L時，對菌體有一定抑制，在250 mg/L時培養24 h，對S.marcescensjx-1抑制率為21.4%；從生長曲線上來看，抑制主要體現在延滯期延長和穩定期菌體最高產量降低；在本實驗設置的梯度范圍內，S.marcescensjx-1沒有出現完全抑制的生長狀態，表現出對Zn2+較高的耐受性。

3.3 S.marcescens jx-1對重金屬Cr6+的耐受性

根據2.4實驗方法，分別考察37℃(不產靈菌紅素)和28 ℃(產靈菌紅素)條件下，不同濃度的Cr6+對S.marcescensjx-1生長的影響，結果如圖5和圖6所示。

圖5 37 ℃時Cr6+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.5 The effect of Cr6+to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

圖6 28 ℃時Cr6+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.6 The effect of Cr6+to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由圖5可知，不產生靈菌紅素時，50 mg/LCr6+對菌體表現出明顯抑制，培養24 h時抑制率為52.1%，100 mg/L時完全抑制，S.marcescensjx-1對Cr6+最高耐受濃度為50～100 mg/L。由圖6可知，產靈菌紅素時，Cr6+為50 mg/L時，對S.marcescensjx-1表現出一定抑制，培養24 h時抑制率為20.2%，Cr6+為100 mg/L時培養24 h抑制率達到65.4%，最高的耐受濃度在150～200 mg/L，與伍迪等[15]相比，耐受性更強。

3.4 S.marcescens jx-1對重金屬的去除作用

根據實驗方法2.5，對發酵液中剩余重金屬含量進行測定，考察S.marcescenjx-1對重金屬的去除作用，結果如圖7所示。

圖7 S.marcescens jx-1對重金屬的去除作用Fig.7 The removal effect of S.marcescens jx-1 to heavy metal

由圖7可知，S.marcescensjx-1對三種重金屬的去除效果表現為 Zn2+>Cr6+>Cu2+，48 h內的最大去除率分別為63.3%、44.5%、32.3%，這與耐受性實驗結果Zn2+> Cu2+>Cr6+不完全一致。從3.1～3.3實驗結果可知，相較于100 mg/L的Cr6+和Cu2+，菌體對250 mg/LZn2+的耐受性最好，菌體生長性能最佳，通過吸附、絡合、主動吸收等機制[3,15]達到去除Zn2+的效果也相對最好，24 h內達到最大去除率63.3%。100 mg/L的Cr6+和Cu2+對菌體生長的抑制較為接近，24 h的抑菌率分別為63.4%和65.4%， Cr6+的去除率高于Cu2+，這可能與菌體去除重金屬的機制有關。有研究表明，Cr6+能通過與粘質沙雷氏菌的胞外代謝產物靈菌紅素發生粘連而去除發酵液中的Cr6+[13]，細菌對Cu2+的去除一般通過靜電引力和代謝吸收[15]為主，去除率會受到菌體表面帶的負電荷量和代謝效率的影響。

4 結 論

(1)S.marcescensjx-1對Cu2+、Zn2+、Cr6+具有良好的耐受性，耐受性表現為Zn2+> Cu2+>Cr6+。不產靈菌紅素時，Cu2+、Zn2+、Cr6+最大耐受濃度分別為100～150 mg/L、200～250 mg/L、50～100 mg/L；產靈菌紅素時，Cu2+、Zn2+、Cr6+最大耐受濃度分別為150～200 mg/L、>250 mg/L、150～200 mg/L。

(2)S.marcescensjx-1的代謝產物靈菌紅素，有助于增加菌體對重金屬的耐受性。首先S.marcescensjx-1在28 ℃培養時，靈菌紅素合成酶基因得到表達，產生靈菌紅素，對菌體的生長性能有促進作用，菌體最高產量比37 ℃培養時提高200%左右，菌體細胞密度增加，每個菌細胞受到的重金屬損傷程度降低，因此菌體細胞表現出更高的耐受性。其次，有研究表明粘質沙雷氏菌的次級代謝產物靈菌紅素能通過絡合重金屬來減少重金屬對菌體的傷害，從而提高菌體的耐受性[13]，具體機制有待進一步探究。

(3)S.marcescensjx-1對三種重金屬的去除效果表現為 Zn2+>Cr6+> Cu2+，與耐受性實驗結果不完全一致，可能與菌體的吸附機制有關，48 h內的最大去除率分別為63.3%、44.5%、32.3%。