玉屏風(fēng)多糖合生元對熱應(yīng)激草魚免疫性能的影響

劉 華 鄧桃球 史銀魁 于 輝 楊 映 施益如 蔡明燴 段玉婉

(1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣東省動物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 佛山 528225;2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院, 佛山 528225)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)魚類, 具有肉嫩、少刺、營養(yǎng)豐富和口感鮮美等特點(diǎn)。胡宗福等[1]研究表明魚肉中必需氨基酸含量高、種類豐富。黃春紅等[2]研究表明草魚粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量高, 口感鮮美。然而,魚類的體溫的調(diào)控主要依賴水體溫度, 水溫的變化可對硬骨魚的生長和免疫性能產(chǎn)生影響[3,4]。宋文華等[5]研究發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境下, 草魚免疫力下降, 從而導(dǎo)致各類疾病發(fā)生。水溫的急劇變化或者超過魚類適宜溫度范圍都會導(dǎo)致魚類免疫功能的紊亂,使機(jī)體無法正常執(zhí)行免疫功能, 從而增加魚類對病原體的易感性[6,7]。因此, 提高在高溫環(huán)境下水產(chǎn)動物免疫性能的研究應(yīng)用引起高度重視。

玉屏風(fēng)散是由白術(shù)、黃芪和防風(fēng)三味中草藥組成的一種復(fù)合中草藥, 陳向濤[8]通過活性篩得到玉屏風(fēng)散最具藥理活性的多糖類成分就是玉屏風(fēng)多糖(Yu-Ping-Feng Polysaccharide), 具有增強(qiáng)水產(chǎn)動物免疫力, 改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)以及促進(jìn)生長發(fā)育等作用[9,10]。益生菌(Probiotics)是指促進(jìn)其他生物健康的微生物, 如嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌在魚類腸道酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定, 既提高機(jī)體免疫力又促進(jìn)魚類體內(nèi)的糖代謝水平[11],而嗜熱鏈球菌具有生產(chǎn)胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)的生理特性, 已有文獻(xiàn)報(bào)道EPS具有抗氧化[12]和免疫調(diào)節(jié)作用[13]。合生元(Synbiotics)又稱合生素, 是使用益生菌和益生素配伍組成的新型微生態(tài)制劑[14], 而玉屏風(fēng)多糖合生元則是益生菌與玉屏風(fēng)多糖的結(jié)合, 兩者配合能提高玉屏風(fēng)多糖的活性成分和生物學(xué)效價(jià), 充分發(fā)揮出兩者間的協(xié)同效應(yīng)。我們前期的研究表明玉屏風(fēng)多糖和益生菌結(jié)合使用對比單獨(dú)使用復(fù)合益生菌更能提高烏鱧(Channa argus)的抗氧化能力和免疫能力[9]。因此,本研究通過制備玉屏風(fēng)多糖合生元, 改進(jìn)中藥多糖添加劑效果, 研究其對高溫條件下草魚免疫功能的影響, 為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

草魚購自南海百容水產(chǎn)良種有限公司, 無注射疫苗和使用抗生素記錄, 平均體重為(20±2) g。復(fù)合益生菌由嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌和枯草芽孢桿菌按體積為1∶1∶1比例混合后測得嗜酸乳桿菌活菌量為1.0×109cfu/mL, 嗜熱鏈球菌活菌量為1.0×109cfu/mL, 枯草芽孢桿菌活菌量為1.2×109cfu/mL, 菌種均由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。玉屏風(fēng)多糖由佛山德眾藥業(yè)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)飼料配方見表 1。

表1 飼料配方及生化組成(%干物質(zhì))Tab. 1 Feed formulation and biochemical composition (% dry matter)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選平均體重(20±2) g 的健康草魚360尾, 隨機(jī)分為4組, 即對照組(Ⅰ組)和試驗(yàn)組(Ⅱ—Ⅳ組), Ⅰ組飼喂基礎(chǔ)飼料, Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.08%、0.12%和0.20%玉屏風(fēng)多糖, 并在飼喂前按復(fù)合益生菌體積(mL)/飼料重(g)為 1%的劑量添加復(fù)合益生菌(由乳酸菌、嗜熱鏈球菌、枯草芽孢桿菌按體積1∶1∶1比例混合而得)拌料。每組3個重復(fù), 每個重復(fù)30 尾。預(yù)試期10d, 試驗(yàn)期為21d, 每天保持24h充氣增氧, 控制水溫在26—28℃, 每天飼喂2次(8:00和17:00), 日投飼量為魚群總重量的2%—4%, 每次根據(jù)攝食情況進(jìn)行飼喂。

1.3 試驗(yàn)樣品的采集與測定方法

試驗(yàn)樣品的采集在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后, 從各組隨機(jī)選擇體重基本一致的健康草魚在充足的溶氧條件下, 對其進(jìn)行熱應(yīng)激(32—34℃)48h。在熱應(yīng)激0、6h、24h和48h的4個時(shí)間點(diǎn)從各組隨機(jī)抽取3尾草魚進(jìn)行心臟采血, 3000 r/min冷凍離心5min,移取上層血清于1.5 mL EP管中, 編號并置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ隰~體采血后立即解剖并剝離其肝臟, 編號并置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

血清、肝臟生化指標(biāo)的測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和肝胰臟樣品中總超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(TAOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)和丙二醛(MDA)含量的測定均按照試劑盒說明書進(jìn)行。所有試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

草魚肝臟相關(guān)基因表達(dá)量的測定分別用試劑盒提取總 RNA 與cDNA反轉(zhuǎn)錄, 試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

以草魚β-actin為管家基因, 并參考文獻(xiàn)[15,16]及NCBI上公布的草魚Nrf2、Keap1、Cu-Zn SOD、GSH-Px、HSP70、GR、MHCII和IL-8基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物序列(表 2), 并由上海生工公司合成。對所合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后, 使用1%凝膠電泳檢測樣品DNA質(zhì)量, 并將PCR產(chǎn)物交由上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

表2 目的基因引物序列Tab. 2 Target gene primer sequence

使用PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行定量反應(yīng),反應(yīng)體系20 μL: 2×PerfectStartTMGreen qPCR Super-Mix 10 μL, Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL, Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL, Nuclease-free Water 7.8 μL, Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL, cDNA模板 1 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 94℃ 預(yù)變性30s; 94℃ 5s,60℃ 30s, 72℃ 30s, 40個循環(huán)。目的基因相對表達(dá)量采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 利用DUNCAN氏進(jìn)行多重比較分析,P＜0.05為差異性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 熱應(yīng)激下不同水平玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚血清生化指標(biāo)的影響

由圖 1可知, 各組ALT活力隨時(shí)間的延長呈先升高后降低趨勢, 在應(yīng)激后24h時(shí)達(dá)到最大值, 各組AST活力隨時(shí)間點(diǎn)的延長呈上升趨勢且各時(shí)間點(diǎn)間差異顯著(P＜0.05), 而各添加YPF-P組ALT和AST活力在應(yīng)激前后均低于對照組。在應(yīng)激前,0.12%和0.20%YPF-P組的ALT活力顯著低于對照組(P＜0.05), 0.12%YPF-P組AST活力顯著低于對照組(P＜0.05)。在應(yīng)激后, 各添加YPF-P組ALT 活力在應(yīng)激6h時(shí)均顯著低于對照組(P＜0.05), 而0.12%YPF-P組在應(yīng)激后各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對照組(P＜0.05)。各添加YPF-P組AST活力在應(yīng)激后各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對照組 (P＜0.05), 而0.12%YPF-P組在應(yīng)激48h時(shí)顯著低于其他3組 (P＜0.05)。

圖1 熱應(yīng)激下玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚血清生化指標(biāo)的影響Fig. 1 Effect of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on serum biochemical indexes of grass carp under heat stress

2.2 熱應(yīng)激下不同水平玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚肝臟生化指標(biāo)的影響

由圖 2可知, 各組SOD、T-AOC、GSH-Px活力在應(yīng)激后有先升高后降低趨勢, 在應(yīng)激后6h時(shí)達(dá)到最大值。0.12%和0.20%YPF-P組SOD活力在應(yīng)激前后均高于對照組, 而0.12%YPF-P組SOD活力在應(yīng)激前和應(yīng)激24h時(shí)顯著高于對照組(P＜0.05)。各添加YPF-P組的T-AOC活力在應(yīng)激前后均高于對照組, 但無顯著性差異(P＞0.05)。各添加YPF-P組的GSH-Px活力和GR活力在應(yīng)激前后均高于對照組, 而0.12%和0.20%YPF-P組GSH-Px活力在應(yīng)激6h時(shí)顯著高于對照組(P＜0.05), 0.12%YPF-P組GR活力在應(yīng)激前和應(yīng)激48h時(shí)顯著高于對照組(P＜0.05)。各組MDA 含量在應(yīng)激后呈現(xiàn)上升的趨勢, 在應(yīng)激48h時(shí)MDA含量顯著高于應(yīng)激前(P＜0.05); 各添加YPF-P組MDA含量在應(yīng)激前后均低于對照組, 而0.12% YPF-P組MDA含量在應(yīng)激24h和48h時(shí)顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖2 熱應(yīng)激下玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚肝臟生化指標(biāo)的影響Fig. 2 Effects of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on liver biochemical indexes of grass carp under heat stress

2.3 熱應(yīng)激下不同水平玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚肝臟相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖 3可知, 各組Nrf2相對表達(dá)在應(yīng)激24h和48h時(shí)顯著高于對照(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P組在應(yīng)激0和6h時(shí)Nrf2相對表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05)。除0.12%YPF-P組外其他3組Keap1相對表達(dá)在應(yīng)激24h時(shí)顯著高于應(yīng)激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P組在應(yīng)激0、24h和48h時(shí)均顯著低于對照組(P＜0.05)。各組Cu/Zn-SOD相對表達(dá)量在應(yīng)激48h時(shí)顯著低于應(yīng)激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P組在應(yīng)激0h和6h時(shí)顯著高于對照組(P＜0.05)。各組GSH-Px相對表達(dá)量在應(yīng)激后3個時(shí)間點(diǎn)與應(yīng)激前均無顯著性差異(P＞0.05), 而0.12%YPF-P組在應(yīng)激6h和24h時(shí)顯著高于對照組(P＜0.05)。各組GR相對表達(dá)量在應(yīng)激48h時(shí)顯著低于應(yīng)激前(P＜0.05), 而0.12%和0.20%YPF-P組在應(yīng)激0h、6h和24h時(shí)均顯著高于對照組(P＜0.05)。各組HSP70相對表達(dá)量在應(yīng)激24h和48h時(shí)顯著高于應(yīng)激前(P＜0.05), 且0.12%YPF-P組在應(yīng)激24h和48h時(shí)顯著高于對照組(P＜0.05)。各組IL-8相對表達(dá)量在應(yīng)激48h時(shí)顯著高于應(yīng)激前(P＜0.05), 而0.08%和0.12%YPF-P組在應(yīng)激24h和48h時(shí)均稍低于對照組, 但差異不顯著(P＞0.05)。各組MHCⅡ相對表達(dá)量在應(yīng)激48h時(shí)顯著低于應(yīng)激前(P＜0.05), 而添加YPF-P組在應(yīng)激前后均顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖3 熱應(yīng)激下玉屏風(fēng)多糖合生元對草魚肝臟相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of Yu-Ping-Feng Polysaccharide synbiotics on liver related gene expression of grass carp under heat stress

3 討論

3.1 玉屏風(fēng)多糖合生元對熱應(yīng)激條件下草魚血清免疫酶活力的影響

我們前期的研究表明玉屏風(fēng)多糖可以提高水產(chǎn)動物體內(nèi)抗氧化酶活力, 能夠消除機(jī)體多余的自由基并抑制脂質(zhì)過氧化[10,17,18]。而玉屏風(fēng)多糖合生元有助于益生菌在腸道內(nèi)的生長、繁殖和定植,從而改善機(jī)體腸道菌群平衡和提高其免疫力, 使用效果更佳[19]。ALT和AST為肝臟內(nèi)兩種轉(zhuǎn)氨酶, 是判斷肝細(xì)胞是否損傷的經(jīng)典性指標(biāo), 其活性變化同時(shí)也可以反映魚體的健康狀況[20]。在本研究中, 熱應(yīng)激后草魚血清ALT和AST活力在應(yīng)激后呈升高趨勢, 可能是由于魚體肝臟細(xì)胞膜被破壞, 導(dǎo)致ALT和AST釋放進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng), 進(jìn)而引起血清中這兩種酶活性升高, 與Jeney等[21]報(bào)道的鯉受到環(huán)境脅迫后血清轉(zhuǎn)氨酶活力變化呈上升趨勢研究結(jié)果一致。邵彥翔等[22]、明建華等[15]和王晶晶等[23]的研究結(jié)果也都表明, 熱應(yīng)激會導(dǎo)致水產(chǎn)動物血清中ALT和AST活性升高。本研究結(jié)果表明, 試驗(yàn)組在應(yīng)激前后均能夠不同程度降低草魚血清中ALT和AST活力, 而Ⅲ組ALT和AST活力熱應(yīng)激前后均顯著降低, 這表明該濃度玉屏風(fēng)多糖合生元具有較好的添加效果, 能減少熱應(yīng)激后草魚肝細(xì)胞氧化損傷。

3.2 玉屏風(fēng)多糖合生元對熱應(yīng)激條件下草魚肝臟抗氧化功能的影響

熱應(yīng)激會使魚體內(nèi)自由基增多, 誘發(fā)氧化損傷[24]。魚類肝臟中SOD、GSH-Px和GR等重要的抗氧化酶可以保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[25]。而MDA是機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,熱應(yīng)激后其含量會增加。這表明熱應(yīng)激會使魚類產(chǎn)生大量氧化活性物, 導(dǎo)致魚體發(fā)生劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。劉波等[26]研究發(fā)現(xiàn), 在熱應(yīng)激后羅氏沼蝦肝胰腺T-AOC、SOD、GSH-Px等抗氧化酶活力降低, 而MDA含量增加; 類似的結(jié)果在金魚的研究中也有報(bào)道[27,28]。本研究發(fā)現(xiàn)草魚肝臟中SOD、T-AOC、GSH-Px 和GR活力隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 這可能是由于熱應(yīng)激時(shí)間過長導(dǎo)致產(chǎn)生的自由基數(shù)目過多, 嚴(yán)重超出魚體本身的清除能力, 從而使草魚的抗氧化功能受損。與對照組相比, 試驗(yàn)組的草魚在熱應(yīng)激后肝臟中SOD、T-AOC、GSH-Px 和GR活力均有不同程度的提高, MDA呈降低趨勢, 而Ⅲ組的抗氧化酶活力和MDA含量熱應(yīng)激前后有不同程度地高于或低于其他3組, 表明在飼料中添加適量的玉屏風(fēng)多糖合生元可以提高魚體抗氧化酶的活性, 緩解熱應(yīng)激后草魚肝臟的氧化損傷。

3.3 玉屏風(fēng)多糖合生元對熱應(yīng)激條件下草魚肝臟基因表達(dá)的影響

Nrf2/ARE信號通路在激活后能夠啟動Ⅱ相解毒酶基因、下游抗氧化酶類基因和分子伴侶類基因等的表達(dá)[29]。Nrf2是Nrf2/ARE信號通路的轉(zhuǎn)錄因子[30],Keap1是Nrf2的抑制因子,Nrf2的表達(dá)上調(diào)可以提高建鯉肌肉中SOD1和GSH-PxmRNA的表達(dá)[22]。Nrf2/ARE信號通路抑制IL-8表達(dá)水平[31]。IL-8是一種促炎因子, 能夠趨化和激活中性粒細(xì)胞,釋放超氧化物和溶酶體酶, 促進(jìn)中性粒細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)[32]。由試驗(yàn)結(jié)果可知, 草魚在熱應(yīng)激48h后, 各組肝臟Nrf2、HSP70和IL-8的表達(dá)水平均顯著高于應(yīng)激前, 而抗氧化酶類基因(Cu/Zn-SOD、GSH-Px和GR)mRNA的表達(dá)水平均低于應(yīng)激前, 而抗氧化酶類基因與其相應(yīng)的抗氧化酶活性變化趨勢相似, 這表明可能熱應(yīng)激會導(dǎo)致魚體的炎癥反應(yīng),從而增強(qiáng)Nrf2和HSP70的表達(dá)水平提高魚體的抗氧化應(yīng)激能力, 但Nrf2持續(xù)積累可能對抗氧化酶類基因的表達(dá)有一定的抑制作用, 這與之前的研究類似[33]。MHCⅡ能結(jié)合并呈遞抗原給T淋巴細(xì)胞, 從而激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)[34]。在熱應(yīng)激6h后各組MHCⅡ均呈下降趨勢, 這可能是由于持續(xù)的熱應(yīng)激使魚體肝臟組織受損導(dǎo)致免疫功能下降。在本研究中, 與對照組相比, 添加YPF-P組均能不同程度地提高Nrf2、HSP70、MHCⅡ和抗氧化酶類基因的表達(dá)水平,降低Keap1和IL-8的表達(dá)水平。而Ⅲ組在應(yīng)激前后這些基因分別達(dá)到較高或較低水平, 這可能是由于添加玉屏風(fēng)多糖合生元能增強(qiáng)魚體的抗氧化應(yīng)激能力, 從而減少熱應(yīng)激后的肝臟組織損傷。以上結(jié)果表明在飼料中添加適量的玉屏風(fēng)多糖合生元促進(jìn)MHCⅡ的表達(dá), 并能通過Nrf2/ARE信號通路促進(jìn)草魚肝臟抗氧化酶類基因和分子伴侶類基因的表達(dá)而抑制IL-8的表達(dá)。

4 結(jié)論

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知, 隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長導(dǎo)致草魚的血清和肝臟生化指標(biāo)、相關(guān)基因表達(dá)量均產(chǎn)生了不同程度的變化, 說明熱應(yīng)激后草魚產(chǎn)生了強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)。而玉屏風(fēng)多糖合生元對魚體起到一定的保護(hù)作用, 有助于提高草魚的抗氧化應(yīng)激能力, 有效緩解肝臟氧化損傷, 具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。在本實(shí)驗(yàn)添加水平范圍內(nèi), 飼料中添加0.12%的玉屏風(fēng)多糖合生元的效果最好。