飼料中添加橢圓柵藻對異育銀鯽中科5號越冬后抗病力的影響

許文婕 夏 雨, 朱曉鳴 韓 冬 劉昊昆 楊云霞 解綬啟, , 高 宏 金俊琰

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049;3. 中國科學院種子創新研究院, 北京 100101)

越冬期是魚類養殖階段中的一個關鍵時期[1],低溫和食物缺乏等脅迫會造成魚類代謝紊亂和免疫力下降。在越冬期間, 大口黑鱸(Micropterus salmoides)體重降低[2]。南亞野鯪(Labeo rohita)的非特異性免疫指標隨著季節變化而變化, 且血漿髓過氧化物酶(MPO)活力在冬季顯著低于其他季節[3]。低溫和饑餓會抑制黃姑魚(Nibea albiflora)生長并且導致肝臟抗氧化酶基因表達下調, 抗氧化相關酶活力下降, 影響其肝臟功能和免疫功能[4]。隨著越冬期結束, 水溫逐漸升高, 魚體易受到致病菌的侵入最終導致死亡[4,5], 給水產養殖業帶來巨大的經濟損失[6]。因此, 探究魚類在越冬期間的生理狀態特別是抗病力具有重要的意義, 可為提高養殖魚類越冬期存活率提供一定的理論依據。

藻類富含藻藍蛋白、藻多糖和β胡蘿卜素等物質, 有提高魚類免疫力的作用[7—9]。 在飼料中添加螺旋藻可以提高異育銀鯽中科3號的超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、總抗氧化能力(T-AOC)和白細胞吞噬活性[10]。金頭鯛(Sparus aurataL.)攝食添加微綠球藻(Nannochloropsis gaditana)或四爿藻(Tetraselmis chuii)飼料后血清天然溶血性補體活性顯著增強[11]。在機體感染病菌后, Toll樣受體(TLR)信號通路在非特異性免疫過程中起重要作用, TLR信號通路主要分為髓樣分化因子88(MyD88)依賴性和MyD88非依賴性通路[12]。MyD88和包含Toll/白介素1的接頭蛋白(TIRAP)是MyD88依賴性通路中重要的適配器蛋白, 包含TIR結構域的IFN誘導連接蛋白(TRIF)是MyD88非依賴性通路中重要的適配器蛋白[13]。促炎因子白介素1β(IL1β)和腫瘤壞死因子α1(TNFα1)等在非特異性免疫中起重要作用[14,15]。抗炎因子如轉化生長因子β(TGFβ)和白介素10(IL10)等, 主要起到抑制炎癥反應的過度激活的作用[16,17]。已有研究報道異育銀鯽中科3號攝食螺旋藻后脾臟中Toll樣受體(TLR)信號通路相關基因包括TLR2、MyD88、TIRAP、IL1β、TNFα等表達量顯著高于對照組, 因此螺旋藻粉可以通過TLR信號通路的介導和參與, 最終提高異育銀鯽中科3號的免疫力[10]。

異育銀鯽(Carassius gibelio)是中國重要的經濟性魚類之一, 2019年全國養殖產量近300萬噸[18]。異育銀鯽中科5號是利用銀鯽獨特的異精雌核生殖,以生長優勢和隆背性狀為選育指標, 培育出整入了團頭魴分子模塊的子代, 對皰疹病毒具有較強抗性和耐受性, 并且肌間骨數量顯著低于中科3號, 在2018年被國家原良種委員會鑒定認可為水產養殖新品種[19—22]。異育銀鯽作為大宗淡水魚, 在越冬期間面臨低溫的脅迫。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是異育銀鯽養殖過程中常見的致病菌,會造成敗血癥甚至最終導致死亡[23]。橢圓柵藻(Scenedesmus ovalternusHSJ296)富含α-亞麻酸和其他營養物質[24], 并且可以提高越冬期異育銀鯽中科3號的抗病力[25]。已有研究表明異育銀鯽中科3號和中科5號在免疫力等方面有顯著性差異[26]。因此,本研究的目的是探究在飼料中添加橢圓柵藻是否可以提高越冬期異育銀鯽中科5號的免疫力和抗病力。在異育銀鯽中科5號越冬前期投喂基礎飼料或者添加4%橢圓柵藻的飼料, 并在越冬結束后用嗜水氣單胞菌進行攻毒實驗, 測定其生長、免疫力和抗病力等指標。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

基于實驗室前期的研究結果, 在飼料中添加3.38%的螺旋藻可有效提高異育銀鯽的生長性能和免疫力[10]。因此, 本實驗配置兩種等氮(32%)等脂(10%)的實驗飼料, 分別含有0(DS0)或者4%(DS4)橢圓柵藻(Scenedesmus ovalternusHSJ296), 飼料配方如表 1所示。橢圓柵藻的發酵采用基礎培養基(FeSO4·7H2O, 3 mg/L; K2HPO4, 0.3 g/L; MgSO4·7H2O, 0.3 g/L; KH2PO4, 0.7 g/L; 甘氨酸, 0.1 g/L; 維生素B1, 0.01 mg/L; 維生素A5, 1 mL/L), 氮源為2 g/L KNO3, 碳源為20 g/L葡萄糖。柵藻粉主要營養成分含量(干重): 蛋白質10.16%、脂肪7.10%、水分6.82%和灰分3.88%。所有原料過40目篩后充分混勻, 加水攪拌后用制粒機(SLR-150, 中國水產科學院漁業機械研究所)制粒, 70℃烘烤后4℃保存。

表1 飼料配方和化學組成(g/kg干重)Tab. 1 Ingredients and proximate composition of the experimental diets

1.2 實驗魚和實驗管理

異育銀鯽中科5號來自于中國科學院水生生物研究所官橋漁場, 首先將實驗魚轉移進實驗系統中,飼喂2周以適應養殖環境。實驗開始前, 將實驗魚饑餓24h, 挑選規格均勻且健康的個體進行養殖實驗。實驗設計2個處理組, 每組3個平行, 隨機選取25尾規格均勻且健康的實驗魚[初重(109.24±0.23) g]稱重后放入每個水族缸中。投喂實驗持續4周, 每天兩次飽食投喂(9:00和15:00)。實驗期間水溫變化情況見圖 1, 水體氨氮含量維持在＜0.1 mg/L, 溶氧＞6 mg/L, 余氯＜0.01 mg/L, 光照周期為12L∶12D(8:00—20:00光亮)。投喂實驗周期為2017年12月30日至2018年1月26日, 在投喂實驗結束后(2018年1月26日)所有處理組停止投喂至越冬期結束(2018年3月16日), 越冬期結束后對實驗魚進行攻毒實驗。

圖1 實驗期間水溫變化情況Fig. 1 Water temperatures during the experiment

1.3 攻毒實驗

本實驗使用嗜水氣單胞菌進行攻毒實驗, 首先將嗜水氣單胞菌接種到腦心浸液肉湯(BHI)固體培養基中復蘇生長后, 挑選單克隆接種到BHI液體培養基中于30℃下培養6h, 然后離心(3500×g, 10min)收集沉淀物, 用PBS沖洗3次后獲得攻毒實驗菌種。在正式實驗之前, 先進行預實驗, 確定本實驗異育銀鯽7d半致死嗜水氣單胞菌濃度為1×109CFU/mL。

在越冬結束后, 每缸選取15尾異育銀鯽通過腹腔注射嗜水氣單胞菌(2.8×109CFU/mL, 0.2 mL/100g魚體重)進行攻毒實驗, 其中2尾魚取樣, 13尾魚用于統計攻毒后異育銀鯽的累計存活率, 計算公式如下:

存活率(%)=(存活魚總數/起始魚總數)×100%

1.4 樣品采集

在越冬期結束后, 使用麻醉劑MS-222(60 mg/L,Sigma, USA)將實驗魚麻醉后稱總重, 同時每缸取2尾魚進行樣品采集。注射嗜水氣單胞菌10h后, 每缸取2尾魚進行樣品采集。用肝素鈉抗凝劑潤過的注射器從實驗魚尾部靜脈采血, 將血液在4℃下3000×g離心10min(Eppendorf 5417R, Germany)得到上清液為血漿, 保存于-80℃冰箱中用于后續分析。在采血后, 將實驗魚解剖取頭腎組織于液氮中速凍, 隨后轉入-80℃冰箱中保存, 用于總RNA 的提取。

1.5 樣品分析

血漿抗氧化和免疫指標T-AOC、SOD、MPO、丙二醛(MDA)、免疫球蛋白M(IgM)和補體C3(C3)采用商品試劑盒進行測試(南京建成生物工程研究所, 中國南京)。

使用TRIzol(Invitrogen, USA)提取頭腎組織的總RNA, 并通過1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific,USA)檢測總RNA的完整性、濃度和質量。使用MMLV逆轉錄酶(Promega, USA)對RNA進行反轉錄,反轉錄體系20 μL。在羅氏 Light Cycle 480 II PCR儀(Roche, Germany)上進行實時熒光定量反應,測定目標基因的表達量, 以β-actin為內參基因[27],引物序列見表 2。實時熒光定量反應體系為6 μL:2 μL cDNA, 3 μL LightCycle?480 SYBR?Green ⅠMaster(Roche, Switzerland), 0.24 μL Primer forward,0.24 μL Primer reverse, 0.52 μL PCR water。反應條件為: 95℃, 5min; 45個循環的3步擴增(95℃, 10s;56或60℃, 30s; 72℃, 30s)。目標基因相對表達量計算公式如下:

表2 實時熒光定量引物Tab. 2 Primers used for qPCR

式中,E目標基因為目標基因的擴增效率,E內參基因為內參基因β-actin的擴增效率,Ct為臨界循環數[28]。

1.6 數據分析

使用統計軟件SPSS 25.0對實驗數據進行統計分析, 數據以平均數±標準誤表示。首先對實驗數據進行方差齊性檢驗(Levene homogeneity of viarance test); 采用獨立樣本t檢驗(Independent-samplettest)比較對照組和柵藻組或者攻毒前和攻毒后數據的差異,P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 生長結果和攻毒后存活率

在投喂實驗期間, 對照組和柵藻組平均每尾魚的攝食總量分別為(10.98±0.48)和(10.56±0.16) g, 無顯著性差異。如圖 2所示, 異育銀鯽中科5號在飼喂4周后的體重與越冬初期體重無顯著性差異(P＞0.05), 但在越冬結束時體重顯著降低(P＜0.05)。對照組和柵藻組實驗魚的體重在各個時間點無顯著性差異(P＞0.05)。攻毒后累計存活率在兩組間無顯著性差異(圖 3;P＞0.05)。

圖2 異育銀鯽中科5號越冬期間體重變化Fig. 2 Body weight of gibel carp var. CAS Ⅴ during overwintering

圖3 異育銀鯽中科5號攻毒72h累計存活率Fig. 3 The cumulative survival rate of gibel carp var. CAS Ⅴchallenged with Aeromonas hydrophila infection for 72h

2.2 血漿抗氧化和免疫指標

如圖 4所示, 在對照組中, 攻毒顯著降低了實驗魚血漿SOD活力和MDA、C3、IgM的含量(P＜0.05); 在柵藻組中, 攻毒后MPO活力升高, 但是C3、IgM含量顯著降低(P＜0.05)。在攻毒前, 對照組的SOD的活力和IgM的含量顯著高于柵藻組(P＜0.05); 在攻毒后, 對照組T-AOC的活力高于柵藻組, 但是MDA的含量顯著低于柵藻組(P＜0.05)。

圖4 異育銀鯽中科5號在攻毒前和攻毒10h后血漿抗氧化和免疫指標變化Fig. 4 Changes in plasma antioxidant and immunological indices of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

2.3 免疫相關基因和細胞因子相關基因表達

異育銀鯽中科5號在攻毒前后頭腎中TLR通路相關基因表達變化見圖 5。在對照組中, 攻毒后頭腎中MyD88和IκBα基因表達量上調(P＜0.05); 柵藻組, 攻毒會引起TLR4、MyD88、TIRAP、TRIF和IκBα基因表達量上升(P＜0.05)。攻毒前, 各處理間基因表達量無顯著性差異(P＞0.05)。攻毒后, 柵藻組實驗魚頭腎中MyD88基因表達量顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖5 異育銀鯽中科5號在攻毒前和攻毒10h后頭腎中TLR通路相關基因表達Fig. 5 The expression of TLR signaling pathway-related genes in the head kidney of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

如圖 6所示, 在攻毒后對照組實驗魚頭腎中IL1β、TNFα1和IL10基因表達量上調(P＜0.05); 攻毒會引起柵藻組IL1β、TNFα1、IL10和TGFβ基因表達量上升(P＜0.05)。兩個處理間基因表達量在攻毒前無顯著性差異(P＞0.05)。在攻毒后, 攝食柵藻飼料的異育銀鯽中科5號頭腎中IL1β基因表達量顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖6 異育銀鯽中科5號在攻毒前和攻毒10h后頭腎中細胞因子基因表達Fig. 6 Expression of cytokine genes in the head kidney of gibel carp var. CAS Ⅴ pre and 10h post bacterial challenge

3 討論

在本實驗中, 生長結果顯示越冬結束時實驗魚體重顯著下降。已有文獻報道, 越冬會降低魚體重,主要是因為饑餓和低溫脅迫造成的[2]。攝食對照飼料和柵藻飼料的中科5號攻毒后的累計存活率無顯著性差異。但是在異育銀鯽中科3號的研究結果表明柵藻可以提高實驗魚在越冬后攻毒后累計存活率[25]。本實驗選擇的研究對象是異育銀鯽中科5號,已有文獻報道證明中科3號和中科5號在代謝和免疫等方面有顯著差異[26], 因此, 柵藻對越冬期不同品系異育銀鯽免疫力和抗病力的影響存在差異, 具體機制有待進一步的分析。

3.1 飼料中添加橢圓柵藻對血漿抗氧化和免疫指標的影響

血漿中抗氧化能力和細胞因子含量等被認為是衡量魚類健康的重要指標[29]。低溫會誘導機體產生活性氧繼而激活抗氧化系統[4,30]。T-AOC和SOD可以清除代謝過程產生的自由基等物質, 而MDA是衡量魚體氧化應激狀態和脂質過氧化狀態的重要指標[31—33]。本研究顯示, 攻毒前對照組SOD活力高于柵藻組, 攻毒后對照組T-AOC活力高于柵藻組, MDA含量低于柵藻組。因為低溫和攻毒會誘導機體產生自由基等有害物質, 進而抗氧化酶活力會升高去清除自由基[4,30], 柵藻飼料可能具有保護作用, 因此自由基物質產生量低于對照組,最終導致抗氧化酶活力較低。柵藻組的T-AOC活力、SOD活力和MDA含量在攻毒前后無顯著性差異, 可能是攝食柵藻飼料的中科5號抗氧化系統對嗜水氣單胞菌的響應較對照組緩慢。攝食柵藻飼料的中科3號血漿SOD活力和MDA含量在攻毒后也沒有顯著變化[25]。

MPO在機體先天免疫防御中起重要作用, 是中性粒細胞活化的標志, 并且會產生活性中間產物,具有強氧化性, 可以殺滅微生物[34,35]。在本研究中,MPO活力在不同飼料處理中無顯著性差異, 但是柵藻組在攻毒后MPO活力顯著升高。抗病力(嗜水氣單胞菌)較強的南亞野鯪(Labeo rohita)品系MPO活力高于易感品系, 說明MPO可能在抵抗嗜水氣單胞菌過程中起重要作用[36]。盡管攝食柵藻飼料后并沒有提高中科5號攻毒后的存活率, 但是顯著增強的MPO活力表明柵藻一定程度提高了中科5號的免疫力。已有文獻報道, 魚類攝食含有類胡蘿卜素或者其他免疫增強劑可以增強MPO活力[37]。中科3號攝食柵藻飼料后血漿MPO活力同樣在攻毒后顯著升高, 并且高于對照組[25]。

補體系統在先天免疫系統中起重要的作用, 而補體C3是補體系統中重要的組成部分[38]。IgM是魚類調節獲得性免疫中關鍵的物質[39], 已有研究報道急性和慢性的冷應激都會造成肉雞IgM表達量的升高[40]。在投喂實驗結束后, 實驗魚保持饑餓狀態至越冬期結束, 越冬結束后(即攻毒前)對照組中科5號血漿IgM含量顯著高于柵藻組, IgM含量的升高可能是越冬期的低溫應激造成的。因此, 柵藻可能在一定程度上緩解了冷應激對魚體造成的影響。稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)在熒光假單胞菌攻毒后C3和IgM的含量顯著降低[41]。與攻毒前相比, 攻毒后中科5號血漿C3含量和IgM含量顯著降低, 可能與機體免疫力被抑制, 從而導致機體抵抗細菌感染的能力下降有關[42]。

3.2 飼料中添加橢圓柵藻對TLR通路相關基因表達的影響

TLR是魚類先天免疫中重要的組成部分, 特別在抵抗病原體的過程中起重要的作用。TLR2、TLR3和TLR4是Toll樣受體家族中主要的成員[43]。Toll樣受體家族識別病原體關聯分子, 并通過MyD88依賴性或者MyD88非依賴性通路轉化為信號。TIRAP可以激活下游MyD88依賴性通路, 并且通過TLR2和TLR4調節MyD88依賴性通路[44]。TLR3和TLR4 通過TRIF激活MyD88非依賴性通路[45]。已有文獻報道, 細菌感染會顯著上調機體TLR信號通路相關基因表達, 包括TLR2、TLR3、TLR4、MyD88、TIRAP和TRIF等基因[10,46]。本實驗結果顯示嗜水氣單胞菌攻毒后中科5號頭腎中MyD88基因表達顯著升高, 且柵藻組高于對照組。此外, 攝食柵藻飼料的中科5號的TLR4、TIRAP和TRIF基因表達也顯著升高, 而對照組中無顯著性變化。因此, 中科5號攝食柵藻后MyD88依賴性或者MyD88非依賴性通路可能都被激活以抵御病菌的入侵。盡管本實驗中兩個處理組的中科5號攻毒后累計存活率無顯著性差異, 但是前期的實驗證明在飼料中添加螺旋藻可以部分通過增強TLR通路相關基因表達從而有效提高異育銀鯽3號存活率[10]。因此, 在飼料中添加柵藻可能在一定程度上提高中科5號越冬后的抗病力。NF-κB是調節先天性和特異性免疫應答的主要轉錄因子, 在炎癥反應過程中TLR信號通過激活核因子κB(NF-κB)的抑制蛋白從而調控NF-κB介導的轉錄[47]。在本實驗中, 中科5號IκBα基因表達量在攻毒后顯著升高, 表明嗜水氣單胞菌會誘導異育銀鯽的炎癥反應, 與中科3號的研究結果趨勢相同[25]。

TLR信號通路的激發會誘導IL1β和TNFα1基因表達上調[48]。IL1β是一種促炎因子, 并且是機體應對組織損傷、細菌感染等過程的關鍵物質[14]。TNFα也是一種重要的促炎因子, 主要是通過激活內皮細胞進行調節的[15]。在本實驗中, 中科5號頭腎中IL1β和TNFα1基因表達在攻毒后顯著高于攻毒前, 前期的實驗也有相似的結果[10]。同時, 本實驗結果顯示攝食柵藻飼料的中科5號在攻毒后IL1β表達量顯著高于對照組。已有研究證明, 一些飼料添加劑可以誘導IL1β基因表達。鯉攝食螺旋藻后IL1β基因表達量升高[49]; 在金頭鯛的飼料中添加β葡聚糖會誘導頭腎中IL1β的表達。因此, IL10和轉化生長因子TGFβ是兩種重要的抗炎因子[16,17]。在本實驗中, 攻毒后, 攝食不同飼料中科5號頭腎中IL10基因表達顯著升高, 但是僅有柵藻組TGFβ表達量上調, 表明細菌感染會誘導頭腎中抗炎因子的表達且在柵藻組中抗炎因子TGFβ反應更加靈敏。本實驗結果顯示, 攻毒后促炎因子和抑炎因子基因表達量同時增加, 與大口黑鱸的研究結果一致[50]。因為在細菌侵入魚體后, 機體的免疫反應處于一個動態平衡的過程, 細菌會引起機體的炎癥反應, 機體產生大量的促炎因子, 但是促炎因子也會通過增強凋亡和自噬等方式, 甚至促進機體產生抑炎因子來消除細菌帶來的損傷[51]。

綜上所述, 飼料中添加柵藻在一定程度上可以提高越冬后異育銀鯽中科5號的抗病力, 這種調控可能是通過TLR通路來介導的。本研究為提高越冬后魚類免疫力和抗病力提供一定的數據支撐。