草魚感染GCRV后血液中淋巴細胞變化及BCL10表達分析

姜祝祥 郭早棗 鄭國棟 , 鄒曙明 ,

(1. 上海海洋大學農業農村部團頭魴遺傳育種中心, 上海 201306; 2. 農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306;3. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是世界上重要的淡水養殖品種之一, 但草魚易患多種疾病, 其中影響很大的是草魚出血病[1]。草魚出血病目前還沒有有效的治療方法[2], 因此給草魚養殖業造成了巨大的經濟損失[3]。

先天性免疫反應作為魚類抵御病原體入侵的重要屏障, 在抵御草魚出血病中起到了重要作用[4]。先天性免疫反應的組成成分之一是淋巴細胞, 當環境中存在病原體時, 淋巴細胞會給通過先天性免疫反應給宿主發送危險信號[5]。草魚出血病的主要特征是各個組織的充血狀態, 病毒的攻擊會導致血液免疫力的變化, 血液作為免疫反應的一道重要屏障,可以將免疫細胞從一個部位輸送至另一個部位, 充當了免疫系統的管道[6], 血液中產生抗體的B淋巴細胞(漿細胞)更是免疫應答的效應子[7], 可以增強淋巴細胞對GCRV病毒的抵抗能力。

作為先天性免疫反應中重要的調控因子, NF-κB信號通路的激活可以抑制GCRV病毒的感染,BCL10(B-cell lymphoma)基因作為NF-κB通路的上游調節劑, 可以激活NF-κB的信號傳導來抑制病毒復制。目前關于BCL10基因的研究主要集中在人類上[12],BCL10基因最初是從與黏膜相關淋巴樣組織克隆出來的, 它通過將含有CARD的支架蛋白與MALT1對半胱氨酸酶橋接來充當NF-κB信號的誘導劑。而BCL10在魚類抗病研究中鮮有報道, 有研究表明BCL10可以促進淋巴細胞的存活[13], 而BCL10表達的缺乏還會導致適應性免疫反應的缺乏[14], 說明BCL10在免疫反應方面起著重要作用。

在本研究中, 我們觀察到草魚感染GCRV后血液中淋巴細胞的形態和數量均發生了顯著變化, 并且克隆了與之相關的BCL10基因。此外, 還研究了BCL10基因在草魚各個組織中表達情況, 為今后研究BCL10基因在魚類先天性免疫反應中的機理提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用草魚來自上海海洋大學團頭魴遺傳與育種中心, 所有的實驗都是按照上海海洋大學動物實驗倫理委員會批準的指導方針進行的。總共使用了60尾草魚, 平均重量為4.4—6.0 g。本實驗中所有草魚取組織前都先用100 mg/L的MS222(三卡因甲磺酸鹽, Sigma)處理。快速取草魚組織儲存在-80℃冰箱中。

1.2 草魚出血病攻毒實驗

實驗在2個盛有100 L水的充氣玻璃缸(120 cm×40 cm×30 cm)中進行, 對照組和實驗組每組30條草魚, 在病毒注射之前, 將草魚置于(28±1)℃的水溫中暫養1周, 每天投喂2次, 確認無任何疾病后進行攻毒實驗。采用腹腔注射的方式, 對照組按20 μL/g的劑量注射無菌PBS溶液, 實驗組按20 μL/g劑量注射GCRV-II型病毒。該病毒由中國科學院水生生物研究所汪亞平團隊贈送, 毒株S2片段與典型的II型菌株GCRV-HZ08高度相似(98.4%), 被歸為II型GCRV, 命名為GCRV-II, 病毒滴度為2.97×103copy/μL[15]。在注射完GCRV后, 對照組24h后隨機抽取10條草魚, 而實驗組在1d、4d和7d隨機選擇10條魚麻醉后尾靜脈采血方式收集血液, 并進制備血涂片。同時收集鰓、肝胰腺和中腎組織放入-80℃冰箱儲存。

1.3 細胞計數及石蠟切片

將收集到的血液樣本立即滴上載玻片, 隨機輕輕推開。用瑞士-姬姆薩染色液(Baso, 珠海)進行細胞染色。將Wright-Giemsa溶液A(約0.5 mL)添加到涂片中染色1min, 再將Wright-Giemsa溶液B(溶液A的2—3倍)添加到溶液A上, 用膠頭滴管混勻, 靜置10min, 之后用水輕輕沖洗, 晾干。最后放入光學顯微鏡(徠卡, 德國, RM2125RT)中觀察。每尾選取細胞分布均勻的涂片20片, 在Neubauer計算版上進行細胞計數, 并用以下公式計算:

血液中淋巴細胞數(mm3)=N×25/5×10×200×106式中,N表示5個中方格淋巴細胞總數, 25/5代表5個中方格淋巴細胞數換算為一個大格的淋巴細胞數,10為一個大格的淋巴細胞數換算為1 mL稀釋血液中淋巴細胞數, 200為血液稀釋倍數, 106則表示1 L=106mL。

從每條魚上取中腎放入波恩氏溶液中固定20—24h。固定好的組織經過酒精梯度脫水, 二甲苯梯度透明, 石蠟梯度透蠟, 最后放入正方形盒子中包埋。用組織切片機將組織切成5 μm的薄片貼于載玻片之上。采用HE染色法(蘇木精與伊紅對比染色法)染色, 最后用中性樹脂封片。干燥過后用徠卡光學顯微鏡觀察, 并保存觀察到的圖片。

1.4 cDNA合成及BCL10基因克隆、鑒定

根據試劑盒說明書要求, 將收集的草魚的血液、鰓、肝胰腺和中腎用TRIzol試劑(TaKaRa, 日本)提取總RNA, 使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano300微量分光光度計(奧盛, 中國, Nano-300)檢測RNA質量, 反轉錄試劑盒(Prime ScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser)用于合成基因全長 CDS序列克隆的第一鏈 cDNA。

利用本實驗室基因組測序結果搜索到了BCL10基因的Scaffold序列, 在草魚全基因組數據庫中找到了CDS編碼區, 再將得到的CDS序列放在NCBI上Blast比對, 驗證其正確性, 用PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 的方法對BCL10基因進行克隆, 根據Seamless Cloning Kit無縫克隆試劑盒說明書(碧云天, 中國)設計包含同源臂的引物pEGFP-BCL10-F/ pEGFP-BCL10-R(表 1), PCR擴增BCL10全長, 經 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性后, PCR產物用膠回收試劑盒 (天根, 中國) 進行純化。送至上海生工有限公司測序, 驗證序列。

1.5 進化樹分析

通過BLASP和Search對不同物種的BCL10蛋白推測序列進行比較。Compute pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi)預測蛋白分子量和等電點。https://swissmodel.expasy.org/interactive 在線生物信息學網站預測BCL10蛋白的二級結構。MEGA 6.06構建BCL10系統發育樹。

1.6 實時定量PCR(qRT-PCR)分析

運用實時熒光定量PCR技術檢測感染草魚出血病后不同時間段BCL10基因的表達變化, 在CFX96 TouchTMReal-time PCR檢測系統 (Bio-Rad)中進行, 使用primer5.0設計熒光定量引物BCL10-F/R (表 1), 以草魚18S rRNA作為內參基因(18SF/R)[16], 目的基因相對表達量用 2-ΔΔCt方法計算, 用SPSS Statistics 17.0軟件進行單因素方差法分析。

表1 所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.7 統計分析

統計結果(表示為平均值±標準偏差)是通過單向方差分析獲得的, 然后使用IBM SPSS Statistics 22軟件進行Dunnett檢驗進行多次比較。P值＜0.01和＜0.05被認為具有統計學意義。所有實驗至少重復3遍。

2 結果

2.1 感染期間血液及腎組織變化

注射GCRV病毒以后, 草魚血液中的淋巴細胞的變化如圖 1所示, 在對照組中淋巴細胞的數量為(12.13±1.52)×106ind./mL, 與對照組相比, 第1天淋巴細胞數目下降, 第4天顯著下降, 達到最小值。第7天淋巴細胞數目與對照組相比顯著下降, 與第4天相比數目上升。對照組中草魚的中腎組織排列整齊, 第1天基膜間隙開始出現, 第4天時出現了空泡化現象, 第7天時出現了嚴重的空泡變性, 脫落壞死的現象, 大量的炎性細胞浸潤了腎組織(圖 2)。

圖1 感染GCRV以后淋巴細胞的數量變化Fig. 1 Changes in the number of lymphocytes after infection with GCRV

圖2 感染GCRV以后血液及腎組織病理學變化Fig. 2 Pathological changes of blood and kidney after GCRV infection

2.2 草魚BCL10 cDNA序列

本文克隆的草魚BCL10基因序列開放閱讀框為738 bp, 編碼245個氨基酸。經預測其蛋白分子量為 26644.73 ku, 等電點 (pI) 為5.28。通過NCBI BLASP發現,BCL10基因廣泛存在于硬骨魚中,包括鯉科、脂鯉科和遮目魚科。通過在線生物信息學網站https://swissmodel.expasy.org/interactive 預測了草魚BCL10基因的二級結構(圖 3), 發現人類、斑馬魚與草魚BCL10二級結構都以α螺旋為主, 而且結果相似。系統發育樹分析也表明草魚BCL10與其他硬骨魚種的直系同源體均有良好的聚類關系(圖 4), 并且由于物種的巨大進化分離, 魚類BCL10序列分為不同的進化枝。

圖3 預測人類、斑馬魚及草魚BCL10二級結構Fig. 3 The predicted the secondary structure of BCL10 in human,zebrafish and grass carp

圖4 草魚BCL10基因序列構建的系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of grass carp BCL10 sequences in vertebrates

2.3 感染GCRV后BCL10基因表達變化

為了研究草魚在感染GCRV以后BCL10基因在各組中的表達情況, 按20 μL/g注射含GCRV的組織勻漿液以后, 熒光定量 qRT-PCR檢測發現, 與對照組0天相比, 第1天草魚BCL10基因在鰓和肝胰腺中表達量增加, 在血細胞和中腎中表達量顯著增加,第4天BCL10在血細胞、鰓、肝胰腺和中腎中表達量均顯著增加, 第7天BCL10在血細胞和鰓中表達量顯著下降, 肝胰腺和中腎中表達量下降(圖 5)。

圖5 感染GCRV后BCL10在血細胞、鰓、肝胰腺和中腎中的表達情況Fig. 5 The effect of GCRV on the expression of BCL10 in blood cells, gills, hepatopancreas and trunk kidney

3 討論

3.1 感染GCRV后腎組織及淋巴細胞變化分析

魚類腎臟可以通過血液循環清除代謝廢物和調節離子平衡來維持機體的穩定, 是魚體重要的免疫器官之一, 隨著GCRV病毒的入侵, 腎臟中細胞逐漸空泡變性及脫落壞死, 而壞死的腎臟最終會破壞機體的血液循環系統。

轉錄組學分析表明GCRV入侵魚體后會引起一系列凝血[18,19]及炎癥反應, 表明了病毒會入侵了血液的免疫系統。淋巴細胞是先天性免疫反應的一道重要屏障, 在抵御病毒入侵的過程中起著重要作用[18]。淋巴細胞可以分泌多特異性抗體, 它是一種有效的天然抗體, 可以限制病原體的傳播[20]。在病毒入侵魚體后, 血液中的淋巴細胞數量第7天時的增加, 表明GCRV的誘導激活了血液中淋巴細胞的免疫反應。與GCRV相似的是, 尼羅羅非魚感染西尼羅河病毒后, 早期淋巴細胞也會廣泛活化, 第7天后會產生特異性淋巴細胞[21], 說明了淋巴細胞在抵御病毒的重要作用。

3.2 BCL10序列及功能分析

預測的草魚BCL10二級結構圖與人類、斑馬魚和草魚BCL20相似, 說明草魚BCL10基因在長期進化中高度保守。系統發育樹分析表明, 草魚BCL10與其他硬骨魚種的直系同源體均有良好的聚類關系, 這表明它們是硬骨魚特異性基因組復制的結果。

作為控制細胞凋亡的基因[21]和NF-κB炎癥反應通路上的重要調控因子[23,24], 病毒入侵先天性免疫反應系統后,BCL10起到了重要的調控作用[4]。它可以激活和終止免疫細胞信號, 在GCRV入侵魚體后,BCL10首先激活免疫細胞, 接著免疫細胞會調節魚體中由病毒引起的凝血[25,26]和炎癥反應, 在先天性免疫反應[23]中起著重要的作用。

3.3 感染GCRV后各組織BCL10表達分析

本研究首次檢測了GCRV入侵魚體后BCL10基因的表達情況。結果顯示, 隨著GCRV的入侵,BCL10基因表達量在第1和第4天增加, 血細胞和中腎中最為顯著, 第4天血細胞、鰓、肝胰腺和中腎中都顯著增加, 說明血液和腎作為先天性免疫系統的關鍵性組成成分[6,27], 會第一時間響應病毒的入侵。研究表明用強毒性GCRV-CL毒株感染后草魚后, 在鰓、血液和腎臟等組織中病毒拷貝數更高[28],腎臟會啟動自噬機制來抑制病毒復制并減輕炎癥反應[29]。此外, 肝胰腺也會因為GCRV的感染從而釋放儲存的鐵, 鐵超載不利于宿主細胞抵抗病毒感染并對于病原體感染有益[30]。第7天時血液中的淋巴細胞數量升, 說明了體內炎癥反應的發生。BCL10基因會起到激活炎癥反應的作用, 與其在人體內的功能一致[31]。而第7天表達量的下降可能是由于病毒的大量復制直接加劇了機體的炎癥反應, 使得BCL10基因失去了調控炎癥的作用。

綜上所述, 我們首次觀察到了草魚感染GCRV以后血液中淋巴細胞數量及形態變化, 并且研究了中腎組織的病理學特征及淋巴細胞凋亡相關基因BCL10的表達變化。實驗結果表明, 病毒入侵魚體后BCL10表達量先是升高, 到第7天時又下降到正常水平以下。然而現在關于BCL10在草魚出血病中的研究還相對缺乏, 本研究為后續BCL10基因功能方面的研究提供了重要的依據, 為BCL10在先天性免疫反應中的相關作用機制提供了線索。