阿爾茨海默病-痰瘀互結病證結合動物模型的建立與評價

譚愛華 冉思邈 石和元楊 碩*

(1.湖北中醫藥大學附屬黃岡中醫醫院,湖北 黃岡 438000；2.湖北中醫藥大學老年醫學研究所,武漢 430065；3.北京中醫藥大學博士后流動站,北京 100029)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種認知及行為障礙進行性加重的神經系統疾病[1]。據2018 國際阿爾茨海默病報告顯示,全球共有5000 萬AD 患者,平均每3 s 就能增加一例新患者[2]。年齡是AD 的重要發病因素,隨著我國老齡化的加劇,我國將成為AD 的重災區[3]。AD 屬中醫學中“癡呆”“健忘”“不慧”等范疇,“癡呆”之名首見于《華佗神醫秘傳·治癡呆神方》[4]。AD 病機總屬本虛標實,腎精不足為發病基礎,痰、瘀為主要致病因素,痰瘀互結,經脈不暢,精元不能上達于腦,腦竅失養,發為本病[5]。目前AD-痰瘀互結證尚無標準動物模型,本研究以APP/PS1 雙轉基因小鼠為AD 模型動物,通過冰水浴聯合高脂飲食飼喂干預,構建AD-痰瘀互結模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

20 只SPF 級3 月齡APP/PS1 雙轉基因雄性小鼠,5 只SPF 級3 月齡同遺傳背景的C57BL/6J 雄性小鼠,體重均為(25±5)g,均訂購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008],飼養于湖北中醫藥大學實驗動物中心SPF 級屏障環境獨立通氣籠中[SYXK(鄂)2017-0067]。飼養室溫度22℃～25℃,濕度45%～55%,12 h/12 h 晝夜交替。本研究通過了湖北中醫藥大學動物實驗倫理審查([2020]IEC(012)號),實驗期間按照3R 原則給予小鼠人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

小鼠血生化檢測試劑集成夾片(美國IDEXX)；RIPA 裂解液、50×cook tail、PMSF(100 mmol/L)、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、脫脂奶粉、ECL、顯影定影試劑、β-actin、GAPDH、Histone H3、HRP 標記山羊抗兔、HRP 標記驢抗山羊、HRP標記山羊抗小鼠、HRP 標記山羊抗大鼠、轉移緩沖液、電泳緩沖液、TBS 緩沖液均由武漢Servicebio 公司提供；PVDF 膜(Millipore,0.45 μm,0.22 μm)；TWEEN 20 (Solarbio,T8220)；T-Tau 抗體(Servicebio,GB11178)；TNF-α 抗 體(武漢三鷹,17590-1-ap)；IL-10(武漢三鷹,60269-1-ap)；IL1-β(武漢Abclonal,A11369)。

動物獨立通氣籠架(浙江蘇杭,IVC-BP5 型)；高脂飼料(北京華阜康,D12492)；制冰機(廣州思克,MIYA-ICS60 型)；玻璃筒(四川蜀牛,60 cm/1500 mL)；Morris 水迷宮視頻分析系統(安徽正華,ZH0065 型)；血流變分析儀(北京賽科希德,SA-7000)；Catalyst one 動物全自動生化分析儀(美國IDEXX)；酶標檢測儀(BIO-RED)；冷凍離心機(湖南凱達)；雙垂直電泳儀(BIO-RED)；轉印電泳儀(BIO-RED)；感光膠片(日本kodak)；灰度分析軟件(美國Protein Simple,Alpha Ease FC)；勻漿儀(上海測博)；數碼單反相機、鏡頭(日本Canon,EOS 6D Mark Ⅱ；24～70 mm f/2.8 L USM)；140 Color Checker(美國,X-RITE)；D65 國際標準人工日光燈管(荷蘭PHILIPS,6500 k/18 w/30 cm)；攝影箱(浙江昕昱發,Hakutatz 101260cm/LED)；圖片分析軟件Photoshop CC(美國Adobe)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

按照隨機數表法將20 只APP/PS1 雙轉基因小鼠分為4 組:AD-疾病模型組(Alzheimer’s disease model group,記作AD-Model 組)、AD-痰證組(ADPhlegm syndrome group,記作AD-Ps 組)、AD-瘀證組(AD-Blood stasis syndrome group,記作AD-Bss 組)、AD-痰瘀互結組(AD-Phlegm and blood stasis group,記作AD-Pbs 組),每組5 只。同系非轉基因C57BL/6J 小鼠5 只作為空白對照組(Blank control group,記作Control 組)。

1.3.2 實驗動物造模

各組小鼠適應性喂養1 周后開始造模。AD-Ps組小鼠于入室后第8 天開始飼喂高脂飲食,自由飲水,持續14 d。AD-Bss 組小鼠于入室后第8 天開始,每天14:00,將小鼠放入底面直徑為10 cm、深25 cm、壁厚0.2 cm 的玻璃圓桶內,冰水混合物深12 cm 左右,以小鼠后肢不能直接觸到桶底為宜,冰水混合物溫度控制在0℃～4℃。待小鼠在冰水混合物中掙扎動作明顯減少,即將沉至桶底時立即撈出。每天1 次,持續14 d[6]。AD-Pbs 組同時予高脂飲食和冰水浴處理,持續14 d。AD-Model 組和Control組正常飼養,不予處理。

1.3.3 模型評價

(1)Morris 水迷宮法檢測各組小鼠行為學變化

測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分,主要檢測小鼠的運動能力及空間記憶能力。定位航行試驗共歷時5 d,每天訓練4 次。記錄最后一日上平臺潛伏期(單位:s),同時記錄各組小鼠抵達平臺前或90 s 內游泳的總路程(單位:cm),計算平均游泳速度(單位:cm/s)。記錄每只小鼠在水池中的運動路線,生成定位航行試驗運動軌跡圖?？臻g探索試驗在定位航行試驗后,撤去池中水下平臺,記錄各組小鼠穿越原平臺所在位置的次數,記作穿越平臺次數(單位:次),并記錄每只小鼠在水池中的運動路線,生成空間探查試驗運動軌跡圖。

(2)分析比色反應各組小鼠舌色客觀變化

將小鼠用0.3%的戊巴比妥鈉溶液(0.15 mL/10 g)麻醉術后移入攝影箱內,充分暴露小鼠舌頭,標準人工日光下拍照。相同條件下,拍攝140 色Color Checker 標準比色卡。用 Photoshop CC(Adobe)處理小鼠舌面區域圖像,統一調整為成大小為500×500 px 的圖片,顏色選擇sRGB 模式。校正拍攝的標準比色卡,將校正后的各組小鼠舌象圖片分隔為5×5 的區域,分別提取每個區域中心位置R、G、B 數值并計算平均值和r 值,r=R/(R+G+B),用于反映各組小鼠舌色的客觀變化。

(3)血液流變學反應各組小鼠血液粘稠度

各組小鼠實驗前撤去食物,禁食12 h,不禁水。將小鼠用0.3%的戊巴比妥鈉溶液(0.25 mL/10 g)麻醉術后,心臟采血,分裝為兩支,其中一支置于含有肝素的抗凝管中,血液流變分析儀分別檢測血液高切(200/s)、中切(50/s)、低切(1/s)的全血黏度及血漿黏度。

(4)生化分析反應各組小鼠血脂變化

上述采得另外一支血液,分離血清,Catalyst one全自動生化分析儀,分別測定各組小鼠血清中的TC、TG、HDL-C 和LDL-C 的含量。

(5)Western blot 法檢測各組小鼠海馬組織相關蛋白含量

采血后的小鼠迅速斷頭取腦,剝離出海馬組織,提取海馬組織總蛋白,用Western blot 法檢測TNF-α、IL-1β 及T-Tau 蛋白含量。

1.4 統計學方法

所有實驗數據均使用SPSS 23.0 軟件進行分析,Graph Pad Prism 8.0 軟件和Adobe AI 2020軟件繪制統計圖。結果以平均數±標準差()表示,所有數據均保留小數點后3 位。方差齊性檢驗P＞0.05 時,采用t檢驗,方差齊性檢驗P＜0.05 時采用T2檢驗；兩組間比較采用LSD。以P＜0.05 判定差異為有統計學意義,P＜0.01 判定為差異具有高度統計學意義,P＞0.05 判定為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮實驗結果

與Control 組小鼠比較,AD 各組小鼠的平均游泳速度差異無統計學意義(P＞0.05)。AD 各組小鼠的游泳總路程和上平臺潛伏期明顯更多,穿越平臺次數明顯更少,其差異具有統計學意義(P＜0.05)。

與AD-Model 組小鼠比較,各組小鼠的平均游泳速度差異無統計學意義(P＞0.05)。AD 各組小鼠的游泳總路程、上平臺潛伏期和穿越平臺次數差異無統計學意義(P＞0.05)。

說明各組小鼠運動能力沒有明顯差異。與C57小鼠相比,APP/PS1 雙轉基因小鼠的學習記憶能力明顯降低,從統計數據來看,雖然冰水浴和高脂飲食造模處理后的各組小鼠學習記憶能力存在一定的差異,但這些差異并沒有統計學意義(P＞0.05)。統計結果如表1,各組小鼠定位航行試驗和空間探查試驗的運動軌跡代表圖如圖1。

圖1 各組小鼠Morris 水迷宮試驗軌跡圖Note.Upper figure,Positioning navigation test.Lower figure,Space exploration test.Figure 1 Action trajectory diagram of each group of mice in Morris test

表1 各組小鼠Morris 水迷宮檢測結果(,n=5)Table 1 Results of Morris maze test for each group of mice

表1 各組小鼠Morris 水迷宮檢測結果(,n=5)Table 1 Results of Morris maze test for each group of mice

注:與空白對照組比較,*P＜0.05；與AD-疾病模型組比較,△P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared of with the AD-Model group,△P＜0.05.

2.2 舌色客觀化比較實驗結果

與Control 組小鼠相比,AD-Model 組小鼠舌色偏暗紅,但r 值差異并沒有統計學意義(P＞0.05)。其余各組小鼠舌色偏暗紅,r 值差異有統計學意義(P＜0.05)。

與AD-Model 組小鼠相比,AD 各組小鼠舌色偏暗紅,r 值差異有統計學意義(P＜0.05)。對AD-Ps組、AD-Bss 組和AD-Pbs 組進行兩兩LSD比較,ADPs 組、AD-Bss 組小鼠舌色無明顯差異,r 值差異也沒有統計學意義(P＞0.05),而AD-Ps 組和AD-Pbs組、AD-Bss 組和AD-Pbs 組之間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。各組小鼠舌面R、G、B 值及r 值統計表見表2,小鼠舌象圖片見圖2。

圖2 各組小鼠舌象圖片Figure 2 Tongue images of mice in each group

表2 各組小鼠舌面R、G、B 值及r 值(,n=5)Table 2 R,G,B and r values of the tongue photos of mice in each group

表2 各組小鼠舌面R、G、B 值及r 值(,n=5)Table 2 R,G,B and r values of the tongue photos of mice in each group

注:與空白對照組比較,*P＜0.05；與AD-疾病模型組比較,△P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared of with the AD-Model group,△P＜0.05.

2.3 血液流變學檢測實驗結果

與Control 組小鼠相比,AD-Model 組與AD-Ps 組小鼠全血黏度和血漿黏度較高,但其差異無統計學意義(P＞0.05)。AD-Bss 組和AD-Pbs 小鼠全血黏度和血漿黏度明顯升高,具有統計學意義(P＜0.05)。

與AD-Model 組小鼠相比,AD-Ps 組小鼠的全血黏度和血漿黏度均有不同程度升高,但其差異不具有統計學意義(P＞0.05)；AD-Bss 組和AD-Pbs 小鼠全血黏度和血漿黏度明顯升高,具有統計學意義(P＜0.05)。這說明冰水浴處理可以明顯改變小鼠的血液流變,能夠較好地模擬“瘀”的病理狀態。各組小鼠全血黏度和血漿黏度比較見表3。

表3 各組小鼠全血黏度、血漿黏度比較(,mpa/s,n=5)Table 3 Comparison of whole blood viscosity and plasma viscosity of mice in each group

表3 各組小鼠全血黏度、血漿黏度比較(,mpa/s,n=5)Table 3 Comparison of whole blood viscosity and plasma viscosity of mice in each group

注:+:進行冰水浴處理,-:不進行冰水浴處理。各組小鼠與空白對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與AD-疾病模型組組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。Note.+,Ice and water mixture treatment.-,No Ice and water mixture treatment.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared of with the AD-Model group,△P＜0.05,△△P＜0.01.

2.4 血脂檢測實驗結果

與Control 組小鼠相比,AD-Model 與AD-Bss 組小鼠血脂指標差異無統計學意義(P＞0.05)。ADPs 組和AD-Pbs 組小鼠的各項血脂指標均明顯升高,差異均具有高度統計學意義(P＜0.01)。

與AD-Model 組小鼠相比,AD-Bss 組小鼠雖然在血脂指標上略有升高,但其差異不具有統計學意義(P＞0.05)。AD-Ps 組和AD-Pbs 組小鼠的各項血脂指標均明顯升高,差異均具有高度統計學意義(P＜0.01)。

對AD-Ps 組和AD-Pbs 組進行LSD分析,兩者之間的差異不具有統計學意義(P＞0.05)。這說明高脂飲食飼喂可以明顯改變小鼠的血脂指標,能夠較好地模擬“痰”的病理狀態。各組小鼠血脂指標比較見表4。

表4 各組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比較(,mmol/L,n=5)Table 4 Comparison of serum levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C in various groups of mice

表4 各組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比較(,mmol/L,n=5)Table 4 Comparison of serum levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C in various groups of mice

注:各組小鼠與空白對照組組比較,**P＜0.01；與AD-疾病模型組組比較,△△P＜0.01。Note.Compared with the control group,**P＜0.01.Compared of with the AD-Model group,△△P＜0.01.

2.5 Western blot 實驗結果

與Control 組相比,APP/PS1 雙轉基因的各組小鼠的海馬組織的炎癥指標TNF-α、IL-1β 和AD 病理改變指標T-Tau 均明顯升高,其差異均有統計學意義(P＜0.05),這說明轉基因小鼠海馬組織內發生了炎癥反應,并產生了AD 樣病理改變。與ADModel 組比,AD-Bss 組和AD-Ps 組在炎癥指標和AD 病理改變指標上雖然略有區別,但其差異不具有統計學意義(P＞0.05)；而AD-Pbs 組中的炎癥指標和AD 病理改變指標明顯升高,其差異具有統計學意義(P＜0.05)。這說明同時模擬“痰”和“瘀”病理狀態的小鼠AD 病變程度更為嚴重,腦神經炎癥的發生更加明顯。各組小鼠海馬區不同蛋白WB 電泳條帶圖和相對灰度值統計見圖3。

圖3 各組小鼠TNF-α、IL-1β、T-Tau 蛋白表達水平比較Note.A,Western blot electrophoresis band of different proteins in the hippocampal region of each group of mice.B,Relative grayscale values of different proteins in the hippocampal region of each group of mice.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared of with the AD-Model group,△P＜0.05.Figure 3 Comparison of TNF-α,IL-1β and T-Tau protein expression levels in various groups of mice

3 討論

AD 是一種神經系統疾病,以記憶減退、癡呆、生活能力減弱等為主要臨床表現。目前,其發病機制尚不確切,主流觀點認為炎癥反應、Tau 蛋白的過度磷酸化、氧化應激等均可對其造成影響[7]。中醫學認為,老年人脾腎虛弱,無力運化水濕,聚濕成痰?！侗孀C錄》記載:“痰積于胸中,盤踞于心外,使神明不清而成呆病矣”。老年人氣血虛弱,無力推動血液流轉,血停則成瘀?！毒霸廊珪吩?“凡心有瘀血,亦令健忘”[8]。痰瘀互結,阻滯經脈,使氣血精微不能上達腦竅,腦失所養,發為本病。因此,本研究以痰瘀互結證為切入點,建立AD-痰瘀互結證病證結合動物模型。

《醫林改錯·積塊》曰:“血受寒則凝結成塊”。寒邪克表,引起經脈痙攣、瘀阻,血行不暢,進而形成瘀證。郭文鶴、王丹丹等通過降低大鼠體表溫度,獲得瘀證動物模型[9-10]。對于瘀證動物模型的評價可以觀察舌苔的改變,也可通過檢測血液流變學的改變,常選取的指標有血液粘稠度、血漿粘稠度、血沉等[11]?！捌樯抵础?過食肥甘厚膩,損傷脾胃,而致脾胃生化失司,聚液為痰。彭丹虹等通過喂養大鼠高脂飲食,可以獲得以血脂升高為主的痰證動物模型[12]。Lee 等[13]、Han 等[14]通過喂養小鼠高脂飲食,可以穩定的升高小鼠血脂。痰證動物模型的評價,主要通過檢測血脂的改變[15]。辨證論治為中醫的核心思想,以往涉及到AD 的動物實驗主要以病為主,鮮有癥狀的辨識。痰瘀互結為AD 的主要癥狀,本次研究主要通過冰水浴加高脂飲食干預APP/PS1 雙轉基因小鼠來制造AD-痰瘀互結證動物模型。通過觀察小鼠舌色變化、血液流變學改變、血脂改變等評價造模情況,通過水迷宮實驗以及Western blot 實驗評價AD-痰瘀互結證小鼠與正常小鼠的差別。

本次研究結果表明,與Control 組相比較,AD 各組小鼠的平均游泳速度無明顯差異,表明各組小鼠的運動能力無差別。但AD 各組小鼠游泳總路程和上平臺潛伏期明顯增多,穿越平臺次數明顯減少,表明APP/PS1 雙轉基因小鼠的學習記憶能力明顯降于C57 小鼠[16]。AD 各組小鼠的TNF-α、IL-1β、T-Tau 的蛋白含量明顯高于Control 組,表明AD 各組小鼠海馬組織內發生了炎癥反應,并產生了AD樣病理改變[17-18]。說明本次實驗中AD 各組小鼠模型均符合阿爾茨海默病的臨床表現。其中,ADPbs 組各項指標改變最為明顯,其AD 病變程度更加嚴重。

未經過冰水浴及高脂飲食干預的AD-Model 組與Control 組在舌色、血液流變學及血脂方便無明顯差別,表明在干預之前,小鼠無“痰”、“瘀”證的表現。干預之后,與AD-Model 組相比較,AD-Bss 組、AD-Ps 組及AD-Pbs 組小鼠舌色均偏暗紅,AD-Bss組與AD-Pbs 組全血黏度和血漿黏度均升高,AD-Ps組與AD-Pbs 組血脂均升高,其中AD-Pbs 組不但舌色更加暗紅,而且全血黏度、血漿黏度、血脂均明顯升高。實驗表明只接受冰水浴的小鼠,只會形成“瘀”證的病理表現,只接受高脂飲食的小鼠,只會形成“痰”證的病理表現,只有同時接受冰水浴及高脂飲食的小鼠才能形成“痰瘀互結”的病理表現,而且痰瘀癥狀相互搏結,瘀阻經脈,致使“痰”、“瘀”癥狀表現的更加明顯。

本次研究在借鑒以往“痰”、“瘀”動物模型的基礎上,結合AD 病因病機特點,創立AD-痰瘀互結證動物模型。與普通APP/PS1 雙轉基因小鼠相比較,本模型更加貼合中醫辨證論治的思維體系,為相關中藥或方劑研究提供更加準確的動物模型,以期達到方證對應。本模型制備可控性強,能做到統一化建模,且其證候表現與臨床較一致。同時該方法也存在一定的缺點,如造模時間長,操作過程精細,過程繁瑣等。通過以上分析,AD-痰瘀互結證動物模型可為相應研究提供可靠的動物載體。