Nrf2-ARE 信號通路在帕金森病中的作用

劉繼紅 邵思邁 趙振榮 史 洺 郝 莉 張紫娟 張振強*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450046)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是目前除阿爾茨海默病以外的第二大常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其主要以上肢靜止性震顫伴有運動遲緩、僵硬和步態(tài)困難為主要臨床癥狀。隨著老齡化人口的增加,65 歲以上老年人的PD 發(fā)病率急劇上升,已成為全球增長最快的老年神經(jīng)退行性疾病。預(yù)計到2040 年,PD 患者將超過1200 萬[1]。PD 引起的高致殘率給病人、家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

PD 的主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的丟失及紋狀體中多巴胺遞質(zhì)的丟失[2]。迄今為止,還沒有可以阻止PD 進展的有效藥物。雖然抗膽堿能藥、多巴胺類藥和多巴胺受體激動劑已用于治療PD,但其療效不好,副作用也較明顯,因此對于PD 有效藥物的探求迫在眉睫。

PD 的發(fā)病機制涉及多種學(xué)說,如神經(jīng)炎癥學(xué)說,線粒體功能障礙學(xué)說和氧化應(yīng)激學(xué)說等,其中氧化應(yīng)激學(xué)說得到廣泛認可,抗氧化療法逐漸成為近些年來攻克帕金森病的重要研究方向。在神經(jīng)元對抗氧化應(yīng)激的過程中,抗氧化信號通路發(fā)揮了重要作用。Nrf2-ARE(nuclear factor erythroid-2 related factor2,Nrf2/antioxidant response element,ARE)信號通路是一條重要的抗氧化通路,可通過調(diào)控下游抗氧化蛋白的表達進而逆轉(zhuǎn)機體的氧化損傷,降低多巴胺能神經(jīng)元的丟失,已成為研究帕金森病抗氧化療法的重要靶點。本文從抗氧化應(yīng)激的角度探討了Nrf2-ARE通路在帕金森病治療中的作用。

1 氧化應(yīng)激與帕金森病

正常人體中腦黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元通過分泌多巴胺(dopamine,DA)控制運動的靈活和平衡[3]。當(dāng)黑質(zhì)致密部的DA 水平降至70%～80%以下時,會出現(xiàn)包括運動遲緩、靜止性震顫、僵硬和姿勢不穩(wěn)等帕金森病的癥狀[4]。黑質(zhì)致密部的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元丟失的重要機制[5-8]。

氧化應(yīng)激是細胞內(nèi)源性活性氧(rereactive oxygen species,ROS)的代謝失衡即ROS 產(chǎn)生過多而清除減少,它通過對不同的生物分子造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷和改變不同的信號通路而導(dǎo)致毒性[9]。Angelova 等[10]認為氧化應(yīng)激使得脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物代謝失衡,觸發(fā)了神經(jīng)元的壞死和凋亡。Musgrove 等[6]利用體內(nèi)、外實驗證實了ROS 的聚集會引起迷走神經(jīng)背核的α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)向中腦的轉(zhuǎn)移并在中腦神經(jīng)元中異常聚集,觸發(fā)神經(jīng)元的凋亡,因此ROS 的代謝失衡是PD 重要的致病機制。而神經(jīng)元高氧量的需求和高能量的產(chǎn)生,使它成為了ROS 產(chǎn)生的重要場所,也使PD患者中腦黑質(zhì)致密部成為氧化應(yīng)激的主要場所[10-11]。因此抗氧化療法成為研究治療PD 的重要方向。

雖然抗氧化劑在PD 的體內(nèi)外模型中顯示出重要的保護作用,但在臨床試驗中幾乎沒有一種抗氧化劑被證明是有效的[10]。因此科學(xué)家們將研究的重點放在了抗氧化過程的重要信號通路上,如Nrf2-ARE信號通路,因此探究Nrf2-ARE信號通路在生命活動中的抗氧化作用對于阻斷帕金森病的進行性腦損傷具有巨大的研究價值。

2 Nrf2-ARE 信號通路與氧化應(yīng)激

2.1 Nrf2-ARE 信號通路的調(diào)節(jié)機制

核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是真核生物中一個重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子,屬于堿性亮氨酸拉鏈(cap‘n’collarbasic leucime zipper,CNC-bZip)轉(zhuǎn)錄因子家族[12]。Nrf2 由605 個氨基酸組成,可分為七個功能結(jié)構(gòu)域(Neh1-7),其N 端的Neh2 結(jié)構(gòu)域是抑制蛋白E3 泛素連接酶復(fù)合物底物(cullin 3/ring-box1)接頭蛋白Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)的結(jié)合位點,通常情況下,同源二聚體Keap1 通過兩個基序(低親和力的DLG 基序和高親和力的ETGE 基序)與一個Nrf2 分子的Neh2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,一旦結(jié)合,Nrf2 就被Cullin3 精確定位于兩個基序之間的七個賴氨酸殘基上進行泛素化降解,因此在細胞內(nèi)的濃度較低[13-14]。Nrf2 的Neh1 結(jié)構(gòu)域具有其基本的CnC-bZip 基序,在氧化和親電應(yīng)激條件下,由于Keap1 中的半胱氨酸殘基的化學(xué)修飾(例如氧化和烷基化)改變了Keap1 的底物適配器功能,使其不能針對Nrf2 進行降解,但是Nrf2 仍然能夠與Keap1 結(jié)合,使可用的Keap1 同源二聚體飽和,并允許新結(jié)合的Nrf2 移位到細胞核中,同小分子肌動蛋白(small Maf proteins,sMaf)進行二聚化,并與細胞核中的抗氧化反應(yīng)元件ARE序列結(jié)合,促進了抗氧化物的轉(zhuǎn)錄和表達[15]。

抗氧化反應(yīng)元件ARE是Nrf2 的結(jié)合靶點,存在于細胞保護基因的啟動子調(diào)控區(qū)。在正常情況下,ARE被sMaf 蛋白阻斷,sMaf 沒有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,即使與ARE結(jié)合,其靶基因的表達仍不能被激活[16]。而在親電體和活性氧的刺激下,Nrf2 入核與sMaf 形成異構(gòu)二聚體,其形成的二聚體與ARE結(jié)合才能激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]。因此在一般情況下,Nrf2 不能入核進行其下游靶蛋白的表達,但在氧化應(yīng)激條件下Nrf2 可入核并激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。

2.2 Nrf2-ARE 信號通路調(diào)控的下游靶蛋白

Nrf2-ARE通路激活后可調(diào)節(jié)一系列細胞保護蛋白基因的表達,這些蛋白參與了許多細胞過程,包括活性氧的清除、異物代謝、谷胱甘肽和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(又稱還原性輔酶Ⅱ,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NAD(P)H)的穩(wěn)態(tài)以及自噬等[18-19]。我們將這種保護途徑稱為解毒系統(tǒng),其所包含的物質(zhì)包括氧化還原因子(第一階段),結(jié)合酶(第二階段),藥物外排轉(zhuǎn)運體(第三階段)。其中第一階段包括500 多種產(chǎn)物,包括氧化還原平衡因子、應(yīng)激反應(yīng)蛋白、解毒酶和代謝酶的編碼基因,如醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathionine S-transferase,GST)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GSR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)以及羰基還原酶等等。代謝物在此之后經(jīng)歷第二相代謝,在那里它們與大的極性基團(如葡萄糖醛酸、谷胱甘肽、硫酸鹽或甘氨酸)結(jié)合,以增加它們的水溶性并促進它們的排泄[20]。

3 Nrf2-ARE 信號通路的激活與帕金森病

為探究PD 與Nrf2 之間的相關(guān)性,Petrillo 等[21]采集了45 名PD 患者的外周血并對其進行檢測,發(fā)現(xiàn)Nrf2 及其下游靶基因NQO1、谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase,GCL)、GSR 在PD 患者外周血白細胞中表達上調(diào),表明PD 患者Nrf2 通路被激活,并且對細胞的氧化應(yīng)激產(chǎn)生了良性調(diào)節(jié)作用。Nakano-Kobayashi 等[22]在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導(dǎo)的PD 小鼠模型中,檢測到抗氧化藥物可使PD 小鼠紋狀體中Nrf2 及其下游轉(zhuǎn)錄蛋白NAD(P)H、NQO1 和HO-1 均高表達。MPTP 是一種神經(jīng)毒性藥物,對多巴胺能神經(jīng)元具有定向破壞性,可造成實驗小鼠的類PD 運動功能障礙,已被證實是一種重要的帕金森小鼠模型藥物[23-24]。因此,Nrf2-ARE信號通路的激活對于PD中神經(jīng)元的抗氧化具有重要意義。

3.1 Nrf2-ARE 信號通路促進PD 中抗氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致PD 發(fā)病的重要機制,Nrf2-ARE作為一條重要的抗氧化調(diào)節(jié)通路,在PD 的抗氧化中發(fā)揮了重要作用,雖然其具體機制尚未完全闡明,但研究者們已通過建立多種PD 體內(nèi)、外模型,來探究Nrf2-ARE信號通路在PD 中的抗氧化應(yīng)激作用。

3.1.1 Nrf2 調(diào)控NQO1 的表達

越來越多的證據(jù)表明,在PD 患者中DA 的氧化及隨之而來的醌修飾所產(chǎn)生的多巴胺琨(dopamine quinones,DAQ)具有高度的神經(jīng)毒性,是造成多巴胺能神經(jīng)元丟失及PD 運動障礙的重要機制[25]。NQO1 是Ⅱ相解毒酶家族的成員,它可防止環(huán)化醌類化合物在氧化還原循環(huán)過程中產(chǎn)生的破壞作用和氧化應(yīng)激。Luo 等[26]證實了NQO1 在MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠模型中通過抑制ROS 來降低黑質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)毒性。Kaji 等[27]用魚藤酮誘導(dǎo)的PD 小鼠模型進行實驗觀察到Nrf2 的核轉(zhuǎn)位與NQO1 的表達密切相關(guān)。此研究被Monir 等[28]證實,即在魚藤酮誘導(dǎo)的PD 大鼠模型中,通過觀察大鼠紋狀體中Nrf2 與HO-1 和NQO1 表達上調(diào)的一致性,建立起三者之間的密切相關(guān)性。因此,多方面的研究表明了NQO1 為Nrf2 通路下游靶蛋白產(chǎn)物之一。

3.1.2 Nrf2 調(diào)控HO-1 的表達

HO-1 是血紅素加氧酶家族的一員,在體內(nèi)介導(dǎo)有毒的血紅素分解代謝,使之分解為具有清除自由基能力的膽綠素和膽紅素來為細胞提供保護作用[29]。除此之外,在氧化應(yīng)激條件下,HO-1 還可通過保護氧化損傷,調(diào)節(jié)炎癥來調(diào)節(jié)細胞凋亡以促進血管生成[30]。據(jù)報道,HO-1 對多巴胺能神經(jīng)元的保護也可通過激活膠質(zhì)細胞源性和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成來實現(xiàn)。因此,HO-1 在PD 氧化損傷的修復(fù)發(fā)揮著重要作用。

多種證據(jù)已經(jīng)表明HO-1 的表達受到Nrf2 的調(diào)控。Kim 等[31]在MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠模型中,通過Nrf2 激活劑上調(diào)Nrf2 的表達,觀察到HO-1 與之正相關(guān)性表達,這種高表達減輕了小鼠黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的變性以及運動障礙。Kwon 等[32]用6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和氧化應(yīng)激在體外細胞模型中模擬PD 的神經(jīng)病理癥狀,并用金絲桃苷作為治療藥物,觀察到了依賴于Nrf2 的HO-1 的強表達,并且抑制了6-OHDA 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元死亡。而柳雪蕾等[33]在通過艾灸治療6-OHDA 誘導(dǎo)的PD 大鼠模型中觀察到,在紋狀體中檢測到Nfr2 的激活及HO-1 表達的增加。這一點也在其它PD 的體內(nèi)模型被證實,張輝等[34]在魚藤酮塑造的PD 小鼠模型中,用銀杏葉提取物有效地激活了其腦內(nèi)Nrf2-ARE抗氧化通路,誘導(dǎo)HO-1 的高表達,改善其腦內(nèi)的氧化應(yīng)激,保護黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元,進而改善其運動障礙。因此,多方面的證據(jù)表明了HO-1 即為Nrf2 通路下游靶蛋白,在PD 中發(fā)揮了積極作用。

3.2 Nrf2-ARE 促進了PD 中線粒體功能的正常運行

線粒體通常被稱作“能量工廠”,這歸結(jié)于它們在OXPHOS 過程中合成的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)為細胞的生命環(huán)節(jié)提供能量[35]。氧化磷酸化的過程對于神經(jīng)細胞來說至關(guān)重要,因神經(jīng)元中的神經(jīng)代謝較為旺盛,需要高水平的ATP來進行神經(jīng)傳遞和維持跨膜細胞的離子梯度[36]。但同時,線粒體也是細胞內(nèi)源性ROS 的主要來源[37]。線粒體中電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)復(fù)合物I 和II 處的電子泄露、復(fù)合物I的損傷及線粒體的分裂都會導(dǎo)致氧的不完全還原,從而形成超氧化物,對神經(jīng)元造成不可逆的損傷[38]。Petrillo 等[21]的臨床研究證實了Nrf2 在PD患者外周血白細胞中高表達,且參與細胞線粒體中氧化應(yīng)激的防御。

Nrf2 不僅可以通過其下游抗氧化蛋白的表達來抑制線粒體內(nèi)膜上所發(fā)生的氧化損傷,還可通過影響線粒體動力相關(guān)蛋白來影響線粒體的發(fā)生,這主要是通過抑制線粒體的異常分裂來完成的[39]。Zhang 等[40]在魚藤酮誘導(dǎo)的PD 大鼠模型中,使用巖藻糖膠激活Nrf2 通路,改善線粒體形態(tài)和呼吸能力,提高線粒體復(fù)合體I 的活性,降低了PD 模型鼠紋狀體中神經(jīng)元的死亡。

Martinez 等[41]利用魚藤酮和MPTP 誘導(dǎo)了PD小鼠模型,并通過抑制ETC 而誘發(fā)了PD 的相關(guān)運動障礙。Holmstr?m 等[42]利用Nrf2-KO(Nrf2 基因敲除)小鼠胚胎成纖維細胞與野生型小鼠的成纖維細胞對比發(fā)現(xiàn),Nrf2-KO 細胞中的線粒體膜電位顯著降低并觀察到線粒體去極化,ATP 水平降低及呼吸功能受損,而Nrf2 基因激活增加了線粒體膜電位和ATP 水平,提高了線粒體的呼吸速率和氧化磷酸化的效率。

因此,Nrf2 除了通過上調(diào)其下游抗氧化蛋白的表達進行抗氧化應(yīng)激之外,還可提高線粒體膜電位,上調(diào)線粒體呼吸作用,氧化磷酸化和ATP 的合成,并且在維持線粒體動態(tài)平衡等方面都發(fā)揮了重要作用。

3.3 Nrf2-ARE 信號通路抑制了PD 中的鐵死亡

鐵死亡是一種鐵依賴性的、與氧化密切相關(guān)的、非凋亡形式的細胞死亡。鐵是一種在生物圈中普遍存在的過渡金屬,由于其參與電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的作用,對于正常的細胞功能必不可少。但過量的鐵可以產(chǎn)生有毒的ROS,對細胞造成不可逆的損傷[43]。Zucca 等[44]對這一現(xiàn)象做出了更加詳細的解釋,即當(dāng)含有神經(jīng)黑色素的細胞器在衰老過程中積累了大量毒素和鐵時,神經(jīng)退化過程就會被觸發(fā)。這個過程具體來說主要包括:多巴胺可以被鐵氧化形成多巴胺醌,此過程跟與鐵依賴發(fā)生的芬頓反應(yīng)(H2O2被亞鐵還原生成羥自由基-OH,導(dǎo)致的強氧化應(yīng)激反應(yīng))密切相關(guān),多巴胺醌可以進入細胞的毒性途徑,與不同蛋白質(zhì)的氨基酸殘基(主要是半胱氨酸殘基)形成加合物,對蛋白質(zhì)造成損傷。

Nrf2 途徑可通過挽救細胞氧化損傷進而抑制PD 中多巴胺能神經(jīng)元的鐵死亡。Han 等[45]通過對比發(fā)現(xiàn),老齡鼠中腦黑質(zhì)和紋狀體中鐵含量明顯高于青年小鼠,而在過表達Nrf2 的PD 模型鼠中,鐵沉積顯著減少,同時該過表達組的ROS 的生成和氧化應(yīng)激水平被顯著減少。這項研究直接證明了Nrf2通過減少氧化應(yīng)激來降低PD 中腦神經(jīng)元的鐵死亡。而Sun 等[46]做了更加細致的研究,他們在體內(nèi)斑馬魚和體外人多巴胺能細胞系(SH-SY5Y 細胞)模型中通過上調(diào)Nrf2-ARE信號通路,觀察到促進Nrf2 核移位和上調(diào)抗氧化蛋白血紅素加氧酶-1(HO-1) 的表達對 6-羥基多巴胺 (6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導(dǎo)的多巴胺能細胞鐵死亡具有保護作用。

因此,在PD 中,神經(jīng)黑色素的積累導(dǎo)致了細胞內(nèi)鐵的沉積,進而促進了細胞過量的活性氧的生成,觸發(fā)了細胞死亡,但是Nrf2-ARE信號通路可通過促進下游抗氧化蛋白的表達來抑制細胞的這種鐵依賴性死亡。

3.4 Nrf2 其它途徑的神經(jīng)保護作用

值得注意的是,雖然廣泛的研究集中于Nrf2-ARE通路的抗氧化作用,但其抗炎和抗凋亡作用也值得深入研究。

核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是細胞中重要的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子,對具有神經(jīng)毒性的炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮了關(guān)鍵作用[47-48]。Wardyn 等[49]認為Nrf2 的缺失會提高NF-κB 的活性,導(dǎo)致細胞炎癥因子產(chǎn)生增加,而NF-κB 通路又可反向調(diào)節(jié)Nrf2 的轉(zhuǎn)錄和活性,對其靶基因表達有雙重影響,但其相互作用機制尚待進一步研究。

此外,Lim 等[50]通過使用Nrf2 激動劑觀察到MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠模型中線粒體凋亡蛋白的表達下調(diào)從而逆轉(zhuǎn)了線粒體凋亡。推測,Nrf2-ARE通路的激活可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白進而減輕多巴胺能神經(jīng)元的死亡。因此Nrf2-ARE通路不僅在PD 中發(fā)揮了重要的抗氧化作用,而且在抗炎和抗凋亡途徑中也發(fā)揮了不可忽視的作用,但其具體作用機制尚不清楚。

4 結(jié)語

帕金森病的發(fā)病機制至今尚未完全探明,但氧化損傷已被認為是重要的發(fā)病機制,抗氧化療法已成為治療帕金森病的重要研究方向。本文從分子角度結(jié)合近幾年的實驗研究探究了Nrf2-ARE通路在PD 中的抗氧化作用:從Nrf2-ARE通路的結(jié)構(gòu),分析其通過促進下游抗氧化酶的生成,進而逆轉(zhuǎn)了線粒體功能,降低了細胞的鐵死亡途徑。除了抗氧化作用的調(diào)節(jié)之外,Nrf2 還可通過抗炎和抗凋亡途徑,實現(xiàn)對PD 的正向保護調(diào)節(jié)。Nrf2-ARE通路在PD 中的抗氧化作用提示我們在日后對PD 的研究中,可通過探究此通路中相關(guān)蛋白的表達來研究藥物對于PD 的神經(jīng)保護作用,同時,Nrf2-ARE通路在抗炎與抗凋亡途徑的作用機制尚未完全清楚,具有較大的研究潛力,相信通過日后對調(diào)節(jié)此通路的藥物的相關(guān)研究將會為帕金森病患者帶來希望。