阿托伐他汀對自身免疫性腦脊髓炎小鼠髓鞘修復及RhoA/Rock1 通路的影響

張沁麗,王玉芬,劉 紅,劉博雯

(長治醫學院附屬和平醫院神經內科,山西 長治 046000)

多發性硬化癥(multiple sclerosis,MS)是中樞神經系統(central nervous system,CNS)的一種慢性自身免疫性和退行性疾病,其病理改變包括中樞神經系統白質中的多發性脫髓鞘斑塊,并伴有反應性膠質增生和軸突損傷[1]。盡管對MS 的病因、發病機制和治療的研究越來越多,但目前對MS 的治療方案尚相對有限,MS 仍然是世界范圍內的治療挑戰[2]。雖然MS 的病因和機制仍不清楚,但神經炎癥被證明在MS 的發生和發展中發揮了關鍵作用,過度的炎癥會導致細胞死亡和組織損傷,如脫髓鞘損傷和軸突損傷[3]。在成人CNS 中,受損神經元軸突再生不良的部分原因是髓鞘相關軸突生長抑制劑的存在,如髓鞘相關糖蛋白、Nogo、少突膠質細胞-髓鞘糖蛋白等,這些抑制劑可以激活RhoA[4]。研究表明RhoA 的激活會導致生長錐的塌陷和軸突生長的抑制,而RhoA 的失活可以促進受損中樞神經系統的軸突再生和功能恢復,RhoA 的下游效應因子是Rho 相關激酶(Rock),包括Rock1 和Rock2,Rock 活化可促進肌球蛋白輕鏈磷酸酶的磷酸化[5]。因此,我們推測RhoA/Rock 信號通路可能參與自身免疫性腦脊髓炎。他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,廣泛用于降低膽固醇,以減少動脈粥樣硬化和心血管發病率[6]。最近在自身免疫性疾病動物模型中的研究表明,他汀類藥物的抗炎和免疫調節特性可能有益于神經退行性疾病的治療[7]。目前關于阿托伐他汀在治療MS 中的作用機制的研究主要集中在免疫調節方面,關于其是否可通過調節髓鞘修復及RhoA/Rock 通路來改善MS 進展的研究尚少。因此,本研究旨在探討阿托伐他汀對自身免疫性腦脊髓炎小鼠髓鞘修復及RhoA/Rock1 通路的影響,以期為MS 的治療提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

選用30 只SPF 級C57BL/6 雌性近交系小鼠,6～8 周,18～20 g,購自成都達碩實驗動物有限公司[SCXK(川)2020-030],飼養于長治醫學院動物實驗房[SYXK(晉)2022-0001],飼養條件為室溫(24±2)℃的環境中,維持光-暗12 h 循環交替,并予以充足的飼料和潔凈飲水。研究方案經長治醫學院實驗動物倫理委員會批準(IACUC 2019072A),并按照實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.1.2 菌株

結核桿菌H37Ra(批號:RNCC263834)購自美國ATCC 公司。

1.2 主要試劑與儀器

阿托伐他汀(批號:20141008)購自輝瑞制藥；MOG35-55 購自西安聯美生物,純度＞95%桿菌；百日咳素(PTX,批號:C7897)、完全弗氏佐劑(CFA,批號:F5881)購自美國Sigma 公司；蘇木素染液(批號:R20568)、伊紅染液(批號:R24044)購yuanye Bio-Technology Co.,Ltd(上海)；IL-6(貨號:ZC-36404)、TNF-α(貨號:ZC-37624)、NO(貨號:ZCS0647)ELISA 試劑盒購自上海茁彩生物；相關一抗NG2(貨號:#52635)、MBP(貨號:#2396)、RhoA(貨號:#2117)、Rock1(貨號:# 4035)、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(貨號:#32935)購自CST；RNA TRIzol Reagent(批號:15596026)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(貨 號:A44662) 購 自 ThermoFisher SCIENTIFIC(上海)；Western blot 細胞裂解液(貨號:P0013)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0009)購自上海碧云天生物；ECL 發光試劑盒(貨號:E-IR-R307)、Immobilon-PSQ PVDF 膜(貨號:EBC-R266) 購自武漢Elabscience。實時熒光定量(RT-PCR)儀(型號PIKORed 96)和全功能酶標儀MK3 均為美國ThermoFisher 儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型制備及分組

將實驗小鼠隨機分為5 組,空白組、模型組(實驗性自身免疫性腦脊髓炎)、阿托伐他汀組、高脂飲食組、高脂飲食+阿托伐他汀組,每組6 只。建模步驟[8]:將抗原MOG35-55 用生理鹽水稀釋成5 mg/mL,并按1 ∶1 等體積加入CFA,加入結核桿菌H37Ra 使其終濃度為4 mg/mL,充分混合乳化。乳化后按每只0.1 mL 于小鼠脊柱兩側分四點皮下注射,0、48 h 每只小鼠腹腔注射0.5 mL PTX(百日咳毒素500 ng)?？瞻捉M以等量生理鹽水代替MOG多肽,其余步驟和方法相同。

1.3.2 給藥方法

高脂飲食組、高脂飲食+阿托伐他汀組均給予高脂飼料喂養3 周后開始免疫、干預,空白組、模型組、阿托伐他汀組給予普通飼料喂養3 周后開始免疫、干預。阿托伐他汀給藥劑量為8 mg/(kg·d),將40 mg 阿托伐他汀溶于125 mL 的0.1 mol/L PBS溶液中形成混懸液,其終濃度為0.32 mg/mL。免疫后第3 天開始應用小鼠灌胃針每只小鼠每天灌服0.5 mL 混懸液,連續28 d。其中,高脂飼料配比為:膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油10%、普通飼料79%。阿托伐他汀給藥劑量參考Zeyghami 等[9]的報道。

1.3.3 神經功能評分

采用Knoz 評分法[10]評估小鼠病情變化,連續觀察直至動物處死,具體評分標準如下:0 分:無癥狀；1 分:尾部失去張力；2 分:后肢力弱；3 分:后肢癱瘓；4 分:后肢及前肢癱瘓；5 分:瀕臨死亡或死亡。

1.3.4 HE 染色和LFB 染色觀察

蘇木精-伊紅(HE)染色:取小鼠腦脊髓,用4%多聚甲醛固定24 h 后,將組織標本放入含30%蔗糖的4%多聚甲醛中保存,腦脊髓組織石蠟包埋,連續切片,厚度5 μm,用HE 染色評價炎性細胞浸潤情況。并采用雙盲法進行炎細胞浸潤評分:0 分,無炎性細胞浸潤；1 分,腦膜細胞浸潤；2 分,血管周細胞浸潤最多4 個小區域；3 分,血管周細胞浸潤5 個或5 個以上小區域,和/或1 個以上大型細胞浸潤；4 分,大量細胞浸潤,累及20%以上的白質。

固藍(LFB)染色:為了評估脫髓鞘,切片按上述方法處理,并用LFB 染色。將組織切片在60℃的0.1% LFB 溶液中孵育過夜,然后在0.05%的碳酸鋰溶液中進行區分,以區分白質和灰質,最后在光學顯微鏡下觀察切片。采用以下評分標準對小鼠的脫髓鞘情況進行雙盲法評估:0 分,無髓鞘丟失；1 分,小范圍髓鞘丟失；2 分,2 個或3 個小范圍髓鞘丟失；3 分,最多2 個大規模髓鞘丟失；4 分,大范圍髓鞘丟失,累及超過20%的白質。

1.3.5 ELISA 法檢測

按照ELISA 試劑盒說明操作,檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的表達。

1.3.6 透射電鏡觀察

取腦組織,切取胼胝體區域組織,組織塊切成1 mm3×1 mm3×3 mm3大小轉入2.5%戊二醛固定液中4℃固定24 h。組織塊用1%鋨酸后固定2 h,然后梯度丙酮脫水,組織塊用環氧樹脂包被,切取半薄切片1%甲苯胺藍染色后,超薄切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色,在透射電鏡下觀察中樞神經系統胼胝體區髓鞘超微結構改變。

1.3.7 免疫組織化學染色觀察

腦脊髓組織切片脫蠟復水,用3% H2O2室溫孵育30 min,加正常山羊血清后37℃孵育30 min,滴加一抗(NG2、MBP(1 ∶300))37℃孵育1 h。用山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(1 ∶200)室溫孵育2 h。用DAB 試劑顯示陽性細胞,蘇木精復染、酒精鹽酸分化、脫水、中性樹膠封片,顯微鏡觀察,用Image Pro Plus 6.0 軟件對NG2、MBP 進行定量分析。

1.3.8 qRT-PCR 檢測

根據制造商的說明,采用TRIzol 試劑從腦組織或脊髓組織中提取總RNA,然后對RNA 進行量化,將一定量的RNA 逆轉錄成cDNA。隨后使用TaKaRa TB GreenTMPreMix Ex TaqTM的聚合酶鏈式反應對基因表達水平進行定量,用2-ΔΔCT方法計算基因表達水平,并用內源性參考GAPDH 值進行歸一化。本研究中使用的引物序列如表1 所示。qRT-PCR 反應條件為預變性95℃30 s,變性95℃5 s,退火55℃30 s,延伸72℃30 s,45 個循環,記錄CT 值。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.9 Western blot 分析

腦組織用冷PBS 洗滌2 次,用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液從腦組織提取蛋白質,冰上孵育,裂解產物在12000 r/min 下離心15 min,收集上清液,并通過BCA 蛋白檢測試劑盒分析蛋白濃度。然后,將上清液與12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠樣品加載緩沖液混合,并轉移到PVDF 膜(微孔)上,根據制造商的說明,轉移的印跡與封閉劑(5%脫脂牛奶在Tris 緩沖鹽水中)室溫封閉2 h 后,將膜與抗RhoA(1 ∶500)、Rock1(1 ∶500)或β-actin(1 ∶2500)的抗體在4 抗下一起孵育過夜。然后,在搖床上用TBST 緩沖液(含0.1%Tween 20 的Tris 緩沖液,pH=7.6)和生物素化山羊抗兔IgG 抗體孵育2 h。使用增強型化學熒光檢測試劑盒(ECL)進行顯影,使用化學發光成像儀檢測化學發光膜的免疫反應性,并通過使用Image-ProPlus 分析光密度,以β-actin 為內參,對蛋白進行量化,實驗重復3 次。

1.4 統計學方法

使用SPSS 22.0 軟件(IBM Corp.)對數據進行統計分析,數據表示為平均數±標準差(),采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多組間比較分析,方差齊性時用LSD 檢驗,方差不齊時用Tamhane’sT2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 阿托伐他汀對自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經功能評分的影響

與空白組比較,模型組小鼠神經功能評分于給藥前、給藥15 d、給藥28 d 時均明顯升高(P＜0.01),與模型組比較,阿托伐他汀組和高脂飲食+阿托伐他汀組于給藥15 d 和給藥28 d 明顯降低神經功能評分,且28 d 時降低更明顯(P＜0.05),見表2。

表2 各組小鼠神經功能評分Table 2 Neurological function scores of mice in each group

2.2 阿托伐他汀對自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎性腦浸潤和脊髓脫髓鞘的影響

空白組:未見明顯炎性細胞浸潤(炎細胞浸潤評分為0 分)及未發生脫髓鞘改變(脫髓鞘評分0分)。模型組:小鼠腦組織白質區神經纖維束間見較多炎性細胞浸潤,以核呈圓形深染的淋巴細胞為主,部分炎性細胞圍繞在血管周圍；脊髓組織LFB染色可見髓鞘藍染區域的面積顯著減少,可見大面積髓鞘脫失后著色為白色的區域,即發生明顯脫髓鞘改變。阿托伐他汀組和高脂飲食組:小鼠腦組織白質區神經纖維束間見極少量炎性細胞浸潤,以及少量小膠質細胞增生；脫髓鞘程度較模型組好轉。高脂飲食+阿托伐他汀組:小鼠腦組織白質區神經纖維束間見少量淋巴細胞浸潤,少量小膠質細胞增生；脫髓鞘程度較模型組好轉。進一步量化分析,與模型組比較,阿托伐他汀組、高脂飲食+阿托伐他汀組小鼠炎細胞浸潤評分及脫髓鞘評分明顯降低(P＜0.01)(圖1)。

圖1 小鼠炎性腦浸潤和脊髓脫髓鞘變化Note.A,HE staining and quantitative analysis.B,LFB staining and quantitative analysis.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,##P＜0.01.Figure 1 Changes of inflammatory brain infiltration and spinal cord demyelination in mice

2.3 阿托伐他汀對自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎性細胞因子的影響

與空白組比較,模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量明顯升高(P＜0.01),與模型組比較,阿托伐他汀可明顯降低小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO的含量(P＜0.05),見表3。

表3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量Table 3 Contents of TNF-α,IL-6 and NO in serum of mice in each group

2.4 阿托伐他汀對自身免疫性腦脊髓炎小鼠髓鞘再生修復的影響

透射電鏡觀察結果顯示,空白組小鼠的軸突間距、髓鞘板層結構正常。模型組髓鞘呈松散的層狀結構,排列極為松散,部分髓鞘崩解、斷裂、脫失,軸索萎縮變性,結構不清晰。阿托伐他汀組和高脂飲食+阿托伐他汀組可見髓鞘排列松散,少量髓鞘崩解脫失及軸索萎縮,結構尚清晰。高脂飲食組髓鞘呈松散的層狀結構,結構不清晰(圖2A)。免疫組化檢測結果顯示,模型組較空白組NG2、MBP 表達明顯降低(P＜0.01),與模型組比較,阿托伐他汀組NG2、MBP 表達明顯升高(P＜0.01)(圖2B～2E)。qRT-PCR 檢測表明,與空白組比較,模型組MBP、NG2 mRNA 表達明顯降低(P＜0.01),與模型組比較,阿托伐他汀可明顯升高MBP、NG2 mRNA 表達(P＜0.05)(圖2F)。

圖2 各組小鼠髓鞘再生修復情況Note.A,Transmission electron microscope observation.B,MBP immunohistochemical staining.C,NG2 immunohistochemical staining.D,MBP average optical density.E,NG2 average optical density.F,MBP and NG2 mRNA expression.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Figure 2 Remyelination and repair of mice in each group

2.5 阿托伐他汀對自身免疫性腦脊髓炎小鼠RhoA/ROCK-1 通路的影響

與空白組比較,模型組小鼠腦組織RhoA、Rock1 mRNA 和蛋白表達均明顯升高(P＜0.01),與模型組比較,僅阿托伐他汀可明顯降低小鼠腦組織RhoA、Rock1 mRNA 和蛋白表達(P＜0.05),見圖3。

圖3 各組小鼠RhoA/ROCK-1 通路相關因子的表達Note.A,RhoA and Rock1 mRNA expression.B,RhoA and Rock1 protein expression bands.C,RhoA and Rock1 protein expression.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Figure 3 Expression of RhoA/ROCK-1 pathway related factors in each group of mice

3 討論

MS 是一種以自身免疫性炎癥、脫髓鞘和軸突損傷為特征的中樞神經系統慢性疾病[11]。文獻[12]顯示脂質代謝和炎癥途徑在許多點相互交叉調節,并通過局部機制參與調節中樞神經系統的神經功能。不僅如此,Mandoj 等[13]認為與膽固醇異常穩態相關的血栓形成和神經退行性機制可能有助于MS 進展。Tettey 等[14]進行的一項前瞻性隊列研究亦表明高膽固醇水平對于MS 患者產生不利影響,與殘疾及疾病的進展相關。故高脂與MS 之間存在一定聯系。阿托伐他汀作為臨床常用的降血脂藥物,其安全性已經得到肯定,但目前關于其是否可改善MS 髓鞘修復及是否可通過調節降脂水平來改善MS 的研究尚少。EAE 可較好的模擬MS 臨床表現及病理特征,由此,本研究選用MOG35-55 多肽片段誘導EAE 小鼠模型作為研究對象,設置阿托伐他汀組的同時設置高脂飲食組、高脂飲食+阿托伐他汀組,觀察其對髓鞘再生修復情況及對RhoA/Rock-1 通路的影響,為他汀在MS 治療中的應用提供更多依據,為MS 的治療提供更多契機。

神經炎癥是中樞神經系統最基本的保護性反應之一,在許多生理和病理過程中發揮著至關重要的作用[15]。大腦和脊髓作為一種自我防御機制,可以對損傷產生免疫反應,這些反應包括消除侵襲性病原體,清除受損細胞,促進組織修復[16]。然而,神經炎癥過程是一把雙刃劍,在不平衡的條件下,可能導致不同程度的組織損傷和功能障礙[17]。過度的神經炎性反應已被認為是MS 的病因之一,控制炎癥是該病早期的主要治療目標[18]。在EAE 模型小鼠連續給予阿托伐他汀、高脂飲食+阿托伐他汀后,我們觀察到與未治療的小鼠相比,神經學評分被明顯改善,而高脂飲食組小鼠神經學評分未見明顯變化。此外,腦部炎癥浸潤以及脊髓脫髓鞘程度也有所減輕。EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量明顯高于空白組,阿托伐他汀可明顯降低EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量,高脂飲食+阿托伐他汀干預后EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量無明顯變化,但有降低趨勢。在正常的中樞神經系統條件下,NO 調節多種生理過程,如血流、免疫反應和突觸傳遞。然而,越來越多的證據表明iNOS 誘導的高NO 水平與MS的許多病理表現有關[19]。同樣,本實驗證實EAE模型小鼠的NO 含量明顯升高。根據阿托伐他汀緩解EAE 癥狀的功能,阿托伐他汀可下調NO 的產生,高脂飲食+阿托伐他汀組可下調NO 的水平,但無明顯改善。因此,中樞神經系統抗炎能力的明顯提高可能歸因于阿托伐他汀的神經保護作用,飼喂高脂飼料的EAE 小鼠給予阿托伐他汀后TNF-α、IL-6、NO 含量較EAE 模型小鼠有降低趨勢,提示阿托伐他汀可能通過降脂改善MS 病理學特征和促炎因子的表達等。

髓鞘修復被認為是MS 功能恢復的關鍵,然而,脫髓鞘給軸突帶來了巨大的新陳代謝負擔,造成不可逆的損害,導致MS 的永久性神經缺陷[20]。MS的脫髓鞘病變是由神經炎癥和自身免疫機制引起的,然而,中樞神經系統可以在脫髓鞘事件后再生,特別是在MS 的初期。但隨著脫髓鞘攻擊次數的增加和時間的延長,再髓鞘形成的效果似乎降低,并導致具有神經癥狀的損傷[21]。研究已表明IFN-γ誘導的炎癥和少突膠質細胞死亡被認為是MS 病變髓鞘再生不良的主要因素[22]。EAE 中過多的IL-1β 產生會殺死神經元和少突膠質細胞,但也會通過誘導胰島素樣生長因子1(IGF-1)的產生來促進髓鞘再生[23]。此外TNF-α、IL-6 在EAE 小鼠的脫髓鞘免疫炎癥病變中驅動脫髓鞘[24]。由此,探討髓鞘修復對于開發抗MS 進展的恢復性療法至關重要。NG2 是一種表達在少突膠質前體細胞膜上的糖蛋白,可作為少突膠質前體細胞的特異性細胞標志物[25]。MBP 是一種具有黏附作用并在髓鞘的形成中起到關鍵作用的一個重要的髓鞘組成成分[26],在少突膠質前體細胞分化過程中,有絲分裂后期的少突膠質細胞成熟階段,髓鞘抗原MBP 被合成,并在髓鞘外緣形成穩定膜狀板層結構,從而保證了髓鞘的完整性[27]。RhoA/ROCK-1 信號通路是體內普遍存在的信號轉導通路,參與細胞的形態發生、粘附、遷移和增殖等多種生物學過程[28]。在成人中樞神經系統中,受損神經元軸突再生不良的部分原因是髓鞘相關軸突生長抑制劑的存在,如髓鞘相關糖蛋白、Nogo、少突膠質細胞-髓鞘糖蛋白等,這些抑制劑可以激活RhoA[4]。激活的RhoA 會導致生長錐塌陷和軸突生長抑制,而RhoA 的失活可以促進受損中樞神經系統的軸突再生和功能恢復,RhoA 的下游效應因子Rock 活化可促進肌球蛋白輕鏈磷酸酶的磷酸化[5]。本研究結果顯示,阿托伐他汀組和高脂飲食+阿托伐他汀組可見髓鞘排列松散,少量髓鞘崩解脫失,少量軸索萎縮,結構尚清晰；模型組小鼠較空白組NG2、MBP 蛋白及mRNA 表達明顯降低,阿托伐他汀可明顯升高小鼠MBP、NG2 蛋白及mRNA 表達；且模型組小鼠腦組織RhoA、Rock1 蛋白和mRNA 表達均較空白組明顯升高,僅阿托伐他汀可明顯降低小鼠腦組織RhoA、Rock1 蛋白和mRNA 表達。揭示阿托伐他汀在自身免疫性脫髓鞘疾病中的有效保護作用,可能通過降脂改善MS 髓鞘崩解。

綜上所述,阿托伐他汀明顯緩解了EAE 疾病的進展,促進了EAE 髓鞘修復,抑制炎癥因子的產生,并有降低高脂飲食EAE 小鼠神經功能評分及髓鞘崩解的作用,是潛在的治療MS 的藥物,具有新的作用機制,RhoA/Rock-1 可能是治療MS 的一個有前途的治療靶點。