和厚樸酚通過Notch 信號通路抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠免疫失衡并提供肺保護作用

李 彬,甘德堃,王璐璐

(河南省中醫院肺病科,鄭州 450002)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的肺部疾病[1-2]。最近的研究發現,COPD 患者存在T 細胞亞群失衡的免疫紊亂。T 細胞亞群執行以Th1 和Th17 為主的獲得性免疫反應,這種免疫反應可導致COPD 慢性炎癥的持續和擴大,加速氣道重塑,這與COPD 的發病機制和病情加重有關[3]。楊鑫娜等[4]報道,Notch 信號通路可調節COPD 患者Th1/Th2 和Th17/Treg 的免疫失衡,參與COPD 的發病機制。和厚樸酚(honokiol,HNK,C18H18O2)是從厚樸或凹葉厚樸樹皮中提取的一種雙酚類化合物,在中國和日本的傳統醫藥中有廣泛的應用,多用于治療血栓性中風、治療焦慮和胃腸道癥狀,并且還具有心臟保護作用、抗微生物作用、抗炎作用、抗炎作用、抗血管生成作用和抗血管生成作用[5-7]。最近的研究報道和厚樸酚能顯著抑制哮喘小鼠嗜酸性粒細胞浸潤,減輕氣道炎癥,抑制炎性細胞因子的產生,這些結果提示和厚樸酚可能是治療肺哮喘相關疾病的候選藥物[8]。然而,目前尚無文獻報道和厚樸酚在COPD 中的應用效果。因此,本研究旨在揭示和厚樸酚是否可改善COPD 小鼠免疫平衡并提供肺保護作用,并進一步探討Notch 信號通路是否介導和厚樸酚對COPD 的治療機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

30 只6～8 周齡無特定病原體(SPF)雄性BALB/c 小鼠購自凱學生物科技(上海)有限公司[SCXK(滬)2020-0005],平均體重(20±2)g。所有小鼠于溫度(22±1)℃、濕度(50±5)%、光照/黑暗周期12 h/12 h 的SPF 級實驗室內飼養,飼養室位于河南中醫藥大學實驗動物中心[SYXK(豫)2020-0004],不限制食物和水。本研究由河南省中醫院動物實驗倫理委員會批準(IACUC:20200013),實驗研究過程中做到了3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

和厚樸酚(貨號SND-287)購自滁州仕諾達生物科技有限公司；香煙購自河南安陽卷煙廠；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號C0105M)購自碧云天生物技術研究所；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD3 抗體(貨號LM-10498R-FITC)購自上海聯邁生物工程有限公司；RPMI-1640(貨號PM150110A)購自上海雅吉生物科技有限公司；藻紅蛋白-花青苷5(PE/CY5)標記的CD4 抗體(貨號100409)、藻紅蛋白(PE)標記的IL-4(貨號504103)、FITC 標記的IFN-γ(貨號505805)、PE 標記的Foxp3 (貨號364703)和FITC 標記的IL-17A(貨號512303)購自美國Bio Legend 公司；Notch 1(貨號ab52627)、Notch 2(貨號ab245325)、Notch 3(貨號ab23426)、Notch 4(貨號ab184742)、Hes1(貨號ab119776)、Hes5(貨號ab194111)、Hey1(貨號ab154077)和βactin(貨號ab8227)一抗購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶偶聯IgG 二抗(貨號ZB-2306)購自北京中杉金橋生物科技有限公司；IFN-γ (貨號439007)、IL-4(貨號EA-2510)、IL-17(貨號HIL-17A-175)和IL-10(貨號EA-2513)ELISA 試劑盒購自深圳市達科為生物技術股份有限公司。

GYD-003 型動物肺功能測試系統購自法國EMKA 公司；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；BP121S 電子天平購自德國賽多利斯公司；動物恒溫系統ALC-HTP 購自上海奧爾科特生物科技有限公司；Nanodrop 2000 紫外分光光度計、MK3 酶標儀購自美國Thermo 公司；Mini P-4 垂直電泳槽、電泳儀、電轉儀購自美國Bio-Rad 公司；Western blot 顯影儀購自德國QUANTUM 公司；Leica RM2235 石蠟切片機購自德國Leica 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 COPD 模型制備

將小鼠隨機分為3 組:正常對照組(Normal)、COPD 組和COPD+HNK 組,每組10 只。將COPD組和COPD+HNK 組小鼠置于50 cm、30 cm、35 cm的有機玻璃盒子進行香煙煙霧誘導(焦油量:14 mg,煙氣煙堿量:1.1 mg),每天吸煙4 次(4 支,45 min),間隔1 h,連續90 d。從造模第61 天開始,COPD+HNK 組隔日腹腔注射和厚樸酚(HNK,10.00 mg/kg),至第90 天。和厚樸酚的使用劑量參考文獻[9-10]進行設置,前人文獻中和厚樸酚的使用劑量為2～16 mg/kg,因此本文將的劑量設置為10.00 mg/kg。

1.3.2 肺功能測試

治療完成后,采用法國EMKA GYD-003 型動物肺功能測試系統檢測吸氣峰流速(PIF)和呼氣峰流速(PEF)。

1.3.3 肺組織病理形態學觀察

治療完成后,采用頸椎脫位法處死小鼠。取小鼠肺組織,置于10%多聚甲醛溶液中固定。石蠟包埋,切片,然后進行蘇木精-伊紅(HE)染色,檢測方法嚴格按照制造商說明書進行。

1.3.4 小鼠脾T 細胞分離

在無菌條件下,取小鼠脾,研磨后在200 目濾網上濾過,制成單細胞懸液,緩慢加入小鼠淋巴細胞分離液中,以2500 r/min 離心20 min。吸取中間層淋巴細胞,調整細胞數至每毫升1×106個,加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD3 抗體,流式細胞儀檢測總T 細胞(CD3+T)純度。

1.3.5 CD4+T 細胞亞群檢測

使用RPMI-1640 調整脾T 淋巴細胞濃度為每毫升1×106個,細胞中加入藻紅蛋白-花青苷5(PE/CY5)標記的CD4 抗體。然后,用4%多聚甲醛固定細胞。分別加入膜裂解劑、藻紅蛋白(PE)標記的IL-4、FITC 標記的IFN-γ、PE 標記的Foxp3 和FITC 標記的IL-17A。用流式細胞儀檢測Th1、Th2、Th17 和Treg 的表達,計算Th1/Th2 和Th17/Treg 亞群的比值。

1.3.6 Western blot

提取小鼠T 淋巴細胞總蛋白,用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離50 μg 蛋白樣品。將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜30 min。然后將膜與Notch 1/2/3/4(1 ∶500 稀釋)、Hes1(1 ∶1000 稀釋)、Hes5(1 ∶500 稀釋)、Hey1(1 ∶2000 稀釋)和β-actin(1 ∶1000 稀釋)4℃孵育過夜。然后將膜與辣根過氧化物酶偶聯IgG 二抗(1 ∶2000 稀釋)在室溫下孵育2 h,ECL 顯影。β-actin 作為內參蛋白,將目標蛋白的灰度值標準化為β-actin 的灰度值。

1.3.7 血清IFN-γ、IL-4、IL-17 和IL-10 水平檢測

采集小鼠靜脈血,分離血清。采用ELISA 法嚴格按照試劑盒說明書檢測小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17 和IL-10 水平。

1.4 統計學方法

所有實驗數據用SPSS 17.0 統計軟件進行分析。每組數據均以平均數±標準差()表示。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。多重比較采用最低顯著性差法(LSD-t)。P＜0.05 說明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 和厚樸酚對COPD 小鼠肺組織病理變化的影響

通過HE 染色評價各組小鼠肺組織病理變化(圖1)。Normal 組小鼠肺組織結構基本完整,未見明顯病理改變。COPD 組小鼠肺泡間隔內可見炎性細胞浸潤,終末細支氣管遠端氣腔膨脹,間隙變窄,肺泡數明顯減少,肺泡腔擴張,肺泡壁破裂,符合COPD 的病理學表現。COPD+HNK 組小鼠肺組織病變較COPD 組減輕,炎性細胞浸潤減少,肺泡數增多,肺泡腔縮小。

圖1 各組小鼠肺組織的HE 染色Figure 1 HE staining of lung tissue of mice in each group

2.2 和厚樸酚對COPD 小鼠肺功能的影響

HE 染色結果顯示,小鼠肺組織形態符合COPD的病理學表現,表明建模成功。通過吸氣峰流速(PIF)和呼氣峰流速(PEF)評價各組小鼠肺功能,如圖2 所示,與Normal 組相比,COPD 組小鼠的PIF和PEF 均顯著降低(P＜0.05)。與COPD 組相比,COPD+HNK 組小鼠的PIF 和PEF 均顯著升高(P＜0.05)。說明和厚樸酚能改善COPD 模型小鼠的肺功能。

圖2 和厚樸酚對COPD 小鼠肺功能的影響Note.A,Peak inspiratory flow(PIF).B,Peak expiratory flow(PEF).Compared with normal group,*P＜0.05.Compared with COPD group,#P＜0.05.Figure 2 Effect of honokiol on the lung function of COPD mice

2.3 和厚樸酚對COPD 小鼠T 細胞亞群的影響

各組小鼠T 細胞亞群分布如圖3 所示,與Normal 組相比,COPD 組小鼠的Th1 百分比、Th1/Th2 比值、Th17 百分比和Th17/Treg 比值均顯著升高(P＜0.05),而Treg 百分比和Th2 百分比無顯著變化(P＞0.05)。與COPD 組相比,COPD+HNK 組小鼠的Th1 百分比、Th1/Th2 比值、Th17 百分比和Th17/Treg 比值均顯著降低(P＜0.05)。這些結果說明和厚樸酚可改善COPD 小鼠T 細胞亞群。

圖3 和厚樸酚對COPD 小鼠T 細胞亞群的影響Note.A,Mouse spleen Th1 percentage.B,Th2 percentage.C,Th1/Th2 ratio.D,Th17 percentage.E,Treg percentage.F,Th17/Treg ratio.Compared with normal group,*P＜0.05.Compared with COPD group,#P＜0.05.Figure 3 Effect of honokiol on T cell subsets in COPD mice

2.4 和厚樸酚對COPD 小鼠T 細胞Notch 信號通路的影響

通過Western blot 檢測各組小鼠脾T 細胞中Notch 信號通路的蛋白表達(圖4),結果顯示,與Normal 組相比,COPD 組小鼠脾T 細胞中的Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hes5、Hey1的蛋白相對表達量均顯著升高(P＜0.05)。與COPD 組相比,COPD+HNK 組小鼠脾T 細胞中的Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hes5、Hey1的蛋白相對表達量均顯著降低(P＜0.05)。這些結果說明和厚樸酚抑制了COPD 小鼠T 細胞中的Notch 信號通路。

圖4 和厚樸酚對COPD 小鼠T 細胞Notch 信號通路的影響Note.A～G,Relative expression of Notch1,Notch2,Notch3,Notch4,Hes1,Hes5,Hey1 in mouse spleen T cells in sequence.H,Western blot representative band.Compared with normal group,*P＜0.05.Compared with COPD group,#P＜0.05.Figure 4 Effect of honokiol on the Notch signaling pathway of T cells in COPD mice

2.5 和厚樸酚對COPD 小鼠血清細胞因子的影響

通過ELISA 法檢測各組小鼠血清細胞因子水平(圖5),結果顯示,與Normal 組相比,COPD 組小鼠血清中的IFN-γ 和IL-17 水平均顯著升高(P＜0.05),而IL-4 和IL-10 水平顯著降低(P＜0.05)。與COPD 組相比,COPD+HNK 組小鼠血清中的IFNγ 和IL-17 水平均顯著降低(P＜0.05),而IL-4 和IL-10 水平顯著升高(P＜0.05)。說明和厚樸酚影響了COPD 小鼠血清細胞因子的分泌。

圖5 和厚樸酚對COPD 小鼠血清細胞因子的影響Note.A～D,Levels of mouse serum IFN-γ,IL-4,IL-17 and IL-10 in sequence.Compared with normal group,*P＜0.05.Compared with COPD group,#P＜0.05.Figure 5 Effect of honokiol on serum cytokines in COPD mice

3 討論

和厚樸酚最初是從厚樸或凹葉厚樸樹皮中提取的具有抗衰老、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用的一種雙酚類化合物。據報道,和厚樸酚通過激活Akt 介導的膽堿能神經元存活通路改善快速老化SAMP8 小鼠衰老相關的學習和記憶損傷[11]。和厚樸酚通過減少ROS 的產生而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[12]。在腎缺血/再灌注損傷(I/RI)模型中,與I/R 組相比,和厚樸酚預處理降低炎性標志物如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)的表達水平[13]。此外,和厚樸酚在多種癌細胞中顯示出強大的抗腫瘤活性[14-15]。本研究中,和厚樸酚顯著升高COPD 小鼠的PIF 和PEF,并且HE 染色也顯示和厚樸酚減輕了香煙煙霧誘導的肺組織病理變化,說明和厚樸酚能改善COPD 模型小鼠的肺功能。其他學者報道和厚樸酚對哮喘也具有良好的治療作用[8],因此,和厚樸酚在治療肺部疾病方面可能具有較高的潛力。

T 淋巴細胞介導的過度免疫反應在COPD 的發生和發展中起著重要作用,并且這些細胞的數量隨著氣流限制的增加和肺氣腫的加重而增加[16]。T淋巴細胞可以分化為Th1 或Th2 細胞,具體取決于它們產生的細胞因子類型。目前,許多研究發現COPD 存在Th1 介導的免疫應答,表現為IFN-γ(Th1 細胞因子)水平升高,IL-4(Th2 細胞因子)水平降低,Th1/Th2 失衡[17]。另外,IL-17/Treg 的平衡是維持免疫系統穩定和避免過度免疫反應的重要因素。最近的研究發現COPD 患者也存在Th17/Treg 失衡,表現為IL-17(Th17 細胞因子)分泌增加,IL-10(Treg 細胞因子)分泌減少[18]。本研究中,和厚樸酚顯著降低了COPD 小鼠的Th1 百分比、Th1/Th2 比值、Th17 百分比和Th17/Treg 比值,顯著降低IFN-γ 和IL-17 水平,而升高IL-4 和IL-10 水平,糾正了Th1/Th2 和Th17/Treg 細胞失衡。Th1 細胞主要分泌IL-2、IFN-γ 和TNF-α[19]。Th2 細胞主要分泌IL-4,刺激B 淋巴細胞增殖產生IgG 和IgE,并介導體液免疫[20]。此外,高水平的IL-4 可通過激活自然殺傷T 細胞[21]。大量的文獻均證實,Th2 細胞分泌的細胞因子在減輕炎癥方面發揮著重要作用。結合本研究結果可知,和厚樸酚可使COPD 小鼠體內Th1 細胞向Th2 細胞漂移,從而抑制了Th1/Th2細胞失衡引起的過度炎癥反應。IL-17 是中性粒細胞炎癥的關鍵啟動子。既往研究報道COPD 患者IL17 水平升高,這可能導致中性粒細胞募集和浸潤到炎癥部位,最終通過刺激肺微血管內皮細胞產生CXCL8(IL-8)、E-選擇素、血管細胞粘附分子-1 和細胞間粘附分子-1,從而加重COPD[22]。IL-17 可誘導急性炎癥、募集Th17 細胞并激活Th1 細胞以促進細胞免疫反應。IL-10 是B 淋巴細胞的經典刺激物,它通過抑制核因子κB(一種關鍵的炎癥轉錄因子)的表達來抑制Th1 細胞產生TNF-α、IL-2 和IFN-γ[23]。因此,抑制IL-17 的表達并增加IL-10 的表達可通過多種途徑來抑制炎癥。本研究結果說明,和厚樸酚抑制了COPD 小鼠IL-17 的表達并增加IL-10 的表達,從而使Th17 細胞向Treg 細胞漂移,進而抑制了Th17/Treg 細胞失衡引起的過度炎癥反應。另外,Wang 等[24]發現COPD 患者Th17 和調節性T 細胞(Treg)失衡,血清IL-6 和IL-17 水平升高,與用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼氣量(FEV1)、FEV1/FVC 值降低密切相關,這些變化與COPD 患者病情嚴重程度相關?？傊?和厚樸酚通過糾正Th1/Th2 和Th17/Treg 細胞失衡,進而改善了COPD 小鼠的肺功能。

Notch 信號通路是一個高度保守的信號轉導通路,包括4 個同源受體Notch1/2/3/4 和5 個配體Delta1/3/4 和Jagged1/2,它們表達在T 細胞和多個成熟免疫細胞表面,參與T 細胞的分化[25]。在Notch 受體與配體結合后,下游的靶基因被激活以抑制分化調節因子的表達,最終影響細胞的分化、增殖和凋亡[26]。Laky 等[27]發現抗原提呈細胞表面的Delta 樣4(DLL4)與CD4/T 細胞表面的Notch 受體結合,增加IL-2 的分泌,調節適應性免疫反應。Notch1 受體的激活可以調節Th17 細胞分化[28]。楊鑫娜等[4]報道,Notch 信號通路可調節COPD 患者Th1/Th2 和Th17/Treg 的免疫失衡,參與COPD 的發病機制。Notch 配體DLL1 和DLL4 可以誘導Th1細胞分化,抑制Th2 細胞分化,促進CD4+T 細胞分泌IFN-γ,并下調IL-4 和IL-13 水平[25]。在CD4+T細胞的早期激活過程中,Notch 受體已經被激活,并且可以啟動Th17 細胞中的基因轉錄[29]。抑制Notch 信號可以降低外周血中Th17 細胞的百分比,導致Th17/Treg 比值降低,進而減弱Th17 細胞介導的免疫應答,增強Treg 細胞的免疫抑制功能[30]。另外,Notch 受體通過細胞間相互作用和配體結合,以及通過γ-分泌酶的酶解激活下游靶基因Hes 和Hey 家族,這兩個基因共同參與了T 細胞的激活、增殖和分化。本研究中,Notch 信號通路在COPD 小鼠體內被激活,這是Th1 和Th17 介導的促炎性免疫紊亂的主要原因。然而,和厚樸酚顯著降低了COPD 小鼠脾T 細胞中的Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hes5、Hey1 的蛋白表達。結果表明,和厚樸酚通過抑制T 細胞Notch 信號通路的激活降低了COPD 小鼠Th1/Th2 和Th17/Treg 的比例,從而減少血清IFN-γ 和IL-17 的分泌,并促進IL-4 和IL-10 的分泌。

綜上所述,本研究表明香煙煙霧誘導的COPD小鼠模型存在Th1/Th2 和Th17/Treg 細胞失衡。而和厚樸酚通過抑制COPD 小鼠脾T 細胞Notch 信號通路的激活,進而糾正了COPD 小鼠Th1/Th2 和Th17/Treg 細胞的失衡,從而改善了肺功能。