曲美他嗪對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)和軟骨基質(zhì)降解的作用研究*

胡紫薇，茹 曉，藍(lán)逆寒，高 明，鄭 立Δ

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.廣西組織器官修復(fù)醫(yī)用生物材料工程技術(shù)研究中心；2.藥學(xué)院；3.再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性關(guān)節(jié)疾病，病程發(fā)展緩慢，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化[1]。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）主要由蛋白聚糖（GAG）和膠原蛋白組成，OA 的病因主要是ECM 的破壞和軟骨穩(wěn)態(tài)平衡破壞[2]。研究報(bào)道，基質(zhì)降解酶包括金屬蛋白酶，其中基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）與ECM 的分解代謝相關(guān)[3]。ECM 降解是導(dǎo)致OA 進(jìn)展的關(guān)鍵[4]。目前，臨床上治療OA 的主要方式是手術(shù)和藥物治療，藥物治療是目前應(yīng)用最廣泛的治療策略，常使用的藥物包括非甾體抗炎藥、乙酰氨基酚和阿片類鎮(zhèn)痛藥[5]。然而，長(zhǎng)期使用非甾體抗炎藥會(huì)導(dǎo)致消化道潰瘍和胃腸出血等副作用[6]。因此，尋找一種既安全又能抗炎的藥物用于延緩OA的進(jìn)展很有必要。

曲美他嗪是一種保護(hù)心臟的藥物，主要治療心絞痛、左心室功能障礙和心血管重建[7]。此外，曲美他嗪具有抗炎抗氧化的作用,可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)來(lái)預(yù)防左心室重構(gòu)和減少冠狀動(dòng)脈支架植入患者的急性炎癥反應(yīng)[8-9]；并且可以通過(guò)改善心肌梗死區(qū)域的微環(huán)境，通過(guò)保護(hù)缺氧細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激，從而改善心肌梗死和終末期心力衰竭的治療[10]。然而，曲美他嗪對(duì)OA 是否具有抗炎作用鮮少報(bào)道。本研究旨在探討曲美他嗪對(duì)OA的影響，為探討其可是否可作為OA治療的潛在藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 曲美他嗪（純度≥97%）（麥克林，中國(guó)）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（gibico，中國(guó)），0.25%胰蛋白酶，胎牛血清（四季青，中國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8）（Biosharp，中國(guó)）；鈣黃綠素/碘化丙啶（calcein acetoxymethyl ester/propidium iodide，Calcein-AM/PI）染色試劑（碧云天，中國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）；引物（生工，中國(guó)）；白細(xì)胞介素（IL-1β），100×青鏈霉素，CCK-8試劑，蘇木精—伊紅（HE）試劑盒，改良型番紅O-固綠試劑盒（Solarbio，中國(guó)）；總RNA提取試劑盒（Magen，中國(guó)）。1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18 只雄性SD 大鼠（8 周齡）和8 只3～5 d SD 乳鼠購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：202012013。所有雄性SD 大鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)的環(huán)境中，溫度24～26 ℃，12 h 光照，12 h黑暗處理，所有大鼠自由飲水?dāng)z食。

1.1.3 儀器與設(shè)備 細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Forma，美國(guó)）；梯度PCR 儀，熒光酶標(biāo)儀，超凈工作臺(tái)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；正置熒光顯微鏡（Olympus，日本）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）；1 000 轉(zhuǎn)離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；超純水機(jī)（Merck，德國(guó)）。

1.2 軟骨細(xì)胞提取與培養(yǎng)

取3～5 d 齡的SD 乳鼠，頸椎脫臼法處死，在75%酒精消毒，剔除多余的肌肉組織，在無(wú)菌條件下切取膝關(guān)節(jié)軟骨，剪成1 mm的軟骨碎片，置于胰蛋白酶中消化30 min，離心并棄去含有胰蛋白酶上清液，用無(wú)菌的PBS 輕輕吹洗3 次，棄去上清液，使用二型膠原酶消化8 h 過(guò)夜。取上清液離心1 000 r/min，5 min，分離出軟骨細(xì)胞，與DMEM高糖培養(yǎng)基混合均勻，接種在10 mm 培養(yǎng)皿中，在37.4 ℃、5%CO2，95%濕度中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖率

使用CCK-8 試劑盒評(píng)估曲美他嗪對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性作用。軟骨細(xì)胞傳代至2～3 代，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到85%時(shí)，棄去廢棄的培養(yǎng)基，用PBS 沖洗細(xì)胞1 次再加入胰蛋白酶消化后置于96 細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/孔，將其放置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞充分貼壁后，棄去舊的培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基，各濃度組分別加入含有10 ng/mL的IL-1β 和對(duì)應(yīng)濃度的曲美他嗪（0.012 5 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL）的完全培養(yǎng)基各100 μL，對(duì)照組為不添加曲美他嗪等體積的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。加樣完成后，將孔板放置于37.4 ℃條件下24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL 的CCK-8 檢測(cè)試劑，孵育4 h，在波長(zhǎng)為450 nm的條件下檢測(cè)吸光度。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)

將軟骨細(xì)胞按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的分組方法分為對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組加入單純培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組加入含有10 μg/mL IL-1β 培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入含有10 μg/mL IL-1β+0.1 mg/mL 曲美他嗪的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在超凈臺(tái)中將1.5 mm 的玻璃爬片用75%酒精消毒后置于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將軟骨細(xì)胞重懸液接種到6孔板中培養(yǎng)24 h后分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，復(fù)孔為3個(gè)，培養(yǎng)24 h后收樣。

1.5 Calcein-AM/PI 染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞活力

將第3 代軟骨細(xì)胞混懸液置于6 孔板中，混懸液的細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/孔，待細(xì)胞融合達(dá)85%，各組加入對(duì)應(yīng)藥物，在37.4 ℃條件下培養(yǎng)24 h，PBS清洗爬片3 次，加入含有2 μL 碘化吡啶和0.5 μL 的PBS 溶液，室溫避光染色5 min，然后使用正置熒光顯微鏡顯微鏡觀察熒光并獲取圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。紅色熒光代表死細(xì)胞，綠色熒光代表活細(xì)胞，用Image J軟件進(jìn)行量化分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)炎癥基因和軟骨特異性基因的表達(dá)

使用Magen試劑盒提取軟骨細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，進(jìn)行55 個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。用2-ΔΔCT的方法計(jì)算GAPDH、白介素-6（IL-6）、環(huán)氧酶-2（COX-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、MMP-3、MMP-13、性別決定區(qū)域Y 相關(guān)的高遷移率族框9（SOX9）和蛋白聚糖（ACAN）基因表達(dá)相對(duì)量，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 OA模型建立

每只大鼠選取左側(cè)膝關(guān)節(jié)，使用2%的戊巴比妥麻醉大鼠，膝關(guān)節(jié)剔除毛發(fā)碘伏消毒后從外側(cè)切開(kāi)并暴露關(guān)節(jié)囊，并將膝關(guān)節(jié)髕骨移向外側(cè)，找到大鼠的前交叉韌帶并用手術(shù)刀切斷，再將髕骨復(fù)位，并將髕韌帶與周圍皮膚組織縫合，閉合關(guān)節(jié)腔，術(shù)后1 d每只大鼠注射20萬(wàn)U青霉素鈉，連續(xù)注射1周預(yù)防感染。對(duì)照組不切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，其他操作同模型組。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和處理

曲美他嗪作工作液的濃度為0.1 mg/mL。將18只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組（曲美他嗪0.1 mg/mL），每組6 只。避光條件下將曲美他嗪溶解于PBS，配制成0.1 mg/mL的溶液。術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組的大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射100 μL 0.1 mg/mL曲美他嗪，模型組和對(duì)照組分別注射等量的0.9%NaCl溶液，每周注射1次，持續(xù)4周。

1.9 病理學(xué)觀察曲美他嗪對(duì)SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織的影響

取下大鼠膝關(guān)節(jié)用4%多聚甲醛固定3 d，用pH 7.4 的EDTA 溶液將關(guān)節(jié)組織進(jìn)行脫鈣處理，脫鈣4 周直到組織軟化，再用石蠟包埋，切片厚度4 μm，分別用HE試劑盒和改良型番紅O-固綠試劑盒對(duì)切片進(jìn)行HE染色和番紅O-固綠染色（紅色為軟骨組織，綠色為骨組織），根據(jù)Mankin評(píng)分系統(tǒng)[11]進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分，評(píng)分方法為：（1）軟骨結(jié)構(gòu)：正常0 分，表面不規(guī)則1 分，血管翳形成和表面不規(guī)則2分，裂隙進(jìn)入過(guò)渡層3分，裂隙進(jìn)入輻射層4分，裂隙進(jìn)入鈣化層5 分，結(jié)構(gòu)完全被破壞5 分。（2）軟骨細(xì)胞正常0分，彌漫性細(xì)胞增加1分，局部細(xì)胞增加2 分，細(xì)胞數(shù)量明顯減少3 分。（3）軟骨基質(zhì)染色：正常0分，輕度減少1分，中度減少2分，重度減少3分。（4）潮線完整性：完整0分，被血管破壞1分。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曲美他嗪對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性作用

與0 mg/mL 比較，曲美他嗪濃度低于0.1 mg/mL 時(shí)，對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)明顯毒性（P＞0.05），見(jiàn)圖1。因此，選擇曲美他嗪作工作液度為0.1 mg/mL。

圖1 CCK-8 檢測(cè)不同濃度的曲美他嗪對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性作用

2.2 曲美他嗪對(duì)軟骨細(xì)胞活力的作用

綠色熒光代表活細(xì)胞，紅色熒光代表死細(xì)胞。與對(duì)照組比較，模型組的活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，死細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞活力降低（P＜0.001），與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)量增加，死細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞活力提高（P＜0.01），見(jiàn)圖2。表明曲美他嗪具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用。

圖2 Calcein-AM/PI染色檢測(cè)細(xì)胞活力

2.3 曲美他嗪對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥基因和成軟骨基因表達(dá)的作用

與對(duì)照組相比，模型組的成軟骨基因SOX9和ACAN相對(duì)表達(dá)量均降低（均P＜0.05），炎癥基因IL-6、MMP-3、MMP-13、Cox-2及TNF-α相對(duì)表達(dá)量均升高（均P＜0.05）。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組的SOX9和ACAN相對(duì)表達(dá)量均升高（均P＜0.05），IL-6、MMP-3、MMP-13、Cox-2及TNF-α表達(dá)均降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。提示曲美他嗪可逆轉(zhuǎn)體外OA模型的成軟骨基因下調(diào)和高表達(dá)的炎癥基因。

圖3 炎癥基因和成軟骨相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 曲美他嗪對(duì)SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)的影響

對(duì)照組的大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面完整，軟骨細(xì)胞數(shù)量較多；模型組的大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面破壞嚴(yán)重，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少；相較于模型組，實(shí)驗(yàn)組軟骨層的損傷與變形明顯緩解。與對(duì)照組相比，模型組的組織學(xué)評(píng)分升高（P＜0.001）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組的組織學(xué)評(píng)分降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。提示曲美他嗪緩解OA軟骨基質(zhì)的損傷。

圖4 曲美他嗪對(duì)SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)的影響

3 討論

OA 是普遍的關(guān)節(jié)慢性疾病，軟骨退化是其主要的病理改變[12]。由IL-6 等炎癥因子可誘導(dǎo)基質(zhì)降解酶引起ECM 降解，軟骨細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致OA的進(jìn)展[13]。曲美他嗪是一種哌嗪類藥物，臨床上用于治療心肌缺血和心絞痛等心臟疾病，具有維持線粒體正常功能和抗氧化等作用，通過(guò)抗氧化機(jī)制下調(diào)TNF-α、BAX 和VEGF 等免疫因子表達(dá)來(lái)改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌病[8,14]。此外，曲美他嗪通過(guò)Nrf2 激活減輕糖尿病炎癥反應(yīng)[15]。目前曲美他嗪劑型包括注射劑、片劑和凝膠劑等[16-18]。在臨床中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射是一種常用的微創(chuàng)藥理學(xué)治療方法，有利于減輕疼痛和提升關(guān)節(jié)功能[19]。研究報(bào)道，常采用關(guān)節(jié)腔每周注射1 次的方式，連續(xù)治療4 周以上并觀察療效[20]，因此，本研究選用曲美他嗪注射劑進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射給藥，治療4 周以觀察曲美他嗪的作用效果。

CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示，0.1 mg/mL 的曲美他嗪沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，因此選擇曲美他嗪作工作液濃度為0.1 mg/mL。Calcein-AM/PI 染色顯示，曲美他嗪在0.1 mg/mL 濃度下促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，維持細(xì)胞活性，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。

炎癥在OA關(guān)節(jié)病理中起著重要作用[21]，是OA軟骨退化病變的重要因素[22]，這表明緩解炎癥是OA治療的策略。有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-6 與TNF-α 是導(dǎo)致OA 軟骨基質(zhì)損傷的主要炎癥介質(zhì)[23]。本研究結(jié)果表明，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥基因COX-2、TNFα和IL-6的表達(dá)升高，曲美他嗪可抑制IL-1β 誘導(dǎo)COX-2、TNF-α和IL-6的基因表達(dá)，表明其具有潛在的抗炎能力。

ECM 主要由蛋白聚糖和二型膠原組成，OA 中關(guān)節(jié)組織的破壞與關(guān)節(jié)ECM的降解有關(guān)[24]。因此，減少軟骨外基質(zhì)的降解對(duì)OA的治療至關(guān)重要。蛋白聚糖和二型膠原是軟骨形成和維持ECM 的分解代謝穩(wěn)定并促進(jìn)其合成的關(guān)鍵因素[25]。RT-qPCR結(jié)果顯示，曲美他嗪能增加成軟骨基因ACAN和SOX9的表達(dá)。在OA進(jìn)展過(guò)程中，軟骨細(xì)胞代謝變得活躍，產(chǎn)生金屬基質(zhì)降解酶，包括MMP-3、MMP-13，這是ECM 降解的主要因素[13]。本結(jié)果顯示，曲美他嗪能夠抑制MMP-3和MMP-13的基因表達(dá)，并緩解OA 大鼠軟骨損傷，降低組織學(xué)評(píng)分。說(shuō)明曲美他嗪可以抑制ECM 的代謝，維持ECM 的代謝平衡，起到保護(hù)軟骨的作用。

綜上所述，曲美他嗪可以抑制軟骨炎癥反應(yīng)和軟骨基質(zhì)的降解，對(duì)OA具有潛在的治療作用，然而曲美他嗪治療OA的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。