加味消毒飲顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

張 浩，羅朝亮，韋開聽，吳無畏，周賢強(qiáng)，蔣偉哲,△，陳 路

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 530023；3.廣西壯要方醫(yī)院，南寧 530150）

五味消毒飲方出自清代吳謙編纂的《醫(yī)宗金鑒》，處方由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、天葵子等五味藥材組成[1]，作為傳統(tǒng)中藥方劑在我國已有數(shù)百年的應(yīng)用歷史，具有清熱解毒，散結(jié)消腫之功效。廣西壯要方醫(yī)院由宜州民族醫(yī)藥研究所團(tuán)隊創(chuàng)建而成，在長期的臨床醫(yī)療實踐中，根據(jù)風(fēng)熱感冒[2]、咽炎[3]、扁桃體炎[4]、痤瘡[5]等疾病的特點，對五味消毒飲方進(jìn)行了調(diào)整，刪減了紫花地丁和天葵子，增加了清熱解毒功效更佳的黃芩、穿心蓮和梔子藥材，形成了由黃芩、山銀花、穿心蓮、野菊花、蒲公英和梔子這6味藥材組成的“加味消毒飲顆粒”方藥。由于之前一直以處方藥的形式使用，患者用藥不方便，廣西壯要方醫(yī)院則運(yùn)用現(xiàn)代制藥技術(shù)，將該方進(jìn)行了開發(fā)和研制。為了控制加味消毒飲顆粒質(zhì)量，確保臨床用藥的有效性，本文以建立加味消毒飲顆粒劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為目的，通過薄層色譜（TLC）法定性鑒別該制劑中的黃芩、野菊花和梔子等藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中黃芩苷的含量，以期為該制劑建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 儀器

VARIAN 210 高效液相色譜儀（美國瓦里安）；BSA124S 型萬分之一電子分析天平（Sartorius 公司）；UV-1240 型紫外可見光光度計（Shimadzu 公司）；SB-5200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ZF-8型暗箱式四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201821，含量以95.4%計）；黃芩素、漢黃芩素、蒙花苷、梔子苷、黃芩對照藥材、野菊花對照藥材、梔子對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：111595-201808、111514-201706、111528-201710、110749-201919、120995-201810、120995-201707、120986-201610）；加味消毒飲顆粒（廣西壯族自治區(qū)藥用植物園國家工程實驗室制備，規(guī)格：10 g/袋，批號：20200401、20200402、2020403）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 TLC鑒別

1.3.1 黃芩的鑒別方法 取本品5 g，研細(xì)，加水30 mL，超聲處理5 min，用乙酸乙酯萃取3 次，每次20 mL，取乙酸乙酯層，水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液；另取黃芩素和漢黃芩素對照品，加甲醇制成每1 mL 含黃芩素和漢黃芩素各1.0mg 的混合溶液，作為對照品溶液；再取黃芩對照藥材1 g，加乙酸乙酯∶甲醇（3∶1）的混合溶液30 mL，回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 溶解，作為黃芩對照藥材溶液；根據(jù)處方取缺黃芩的其他組方藥材，按制備工藝制成顆粒，同法制成陰性樣品溶液。照TLC法（通則0502）試驗，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸（10∶2∶1∶2）為展開劑，展開，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無此斑點。

1.3.2 野菊花的鑒別 取本品3 g，研細(xì)，加水30 mL，超聲處理30 min，用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘渣加2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液；另取蒙花苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.2mg 的溶液，作為對照品溶液；再取野菊花對照藥材粉末0.3g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液作為對照藥材溶液；根據(jù)處方取缺野菊花的其他組方藥材，按制備工藝制成顆粒，同法制成陰性樣品溶液。照TLC法（通則0502）試驗，吸取上述4種溶液各3 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯∶丁酮∶三氯甲烷∶甲酸∶水（15∶15∶8∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外燈光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無此斑點。

1.3.3 梔子的鑒別 取本品3 g，研細(xì)，加入50%甲醇10 mL，超聲處理40 min，濾過，濾液作為供試品溶液；另取梔子對照藥材1 g，加入50%甲醇10 mL，超聲處理40 min，過濾，濾液作為對照藥材溶液；再取梔子苷對照品，加乙醇制成每1 mL 含4 mg 的溶液，作為對照品溶液；根據(jù)處方取缺梔子的其他組方藥材，按制備工藝制成顆粒，同法制成陰性樣品溶液。照TLC法（通則0502）試驗，吸取上述 4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 板薄層板上，以氯仿∶甲醇∶水∶甲酸（7∶3∶0.5∶0.05）為展開劑，展開，晾干，噴以香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無此斑點。

1.4 黃芩苷含量測定

1.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[6-8]以及多次試驗，確定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇∶水∶磷酸（48∶52∶0.1）為流動相；檢測波長為330 nm；流速為1.0mL/min；柱溫為30°C；進(jìn)樣量為10 μL；理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計應(yīng)不低于5 000。

1.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品0.0255 g（含量以95.4%計）置100 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（濃度0.2433 mg/mL）。再精密量取對照品儲備液5 mL，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，得濃度為0.1217 mg/mL的黃芩苷對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品（批號：20200401），混勻，取適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4.4 陰性樣品溶液的制備 精密稱取缺黃芩的陰性顆粒1 g，按供試品溶液制備方法操作，得陰性樣品溶液。

1.4.5 方法學(xué)考察

1.4.5.1 專屬性考察 按“1.4.1 項”色譜條件，分別精密吸取上述黃芩苷對照品溶液、供試品溶液、黃芩陰性供試品溶液各10 μL 分次注入HPLC 儀中，記錄圖譜。

1.4.5.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品儲備液（濃度0.2433 mg/mL）1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，分別置于不同的10 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度后，過濾，按色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性方程。

1.4.5.3 精密度試驗 取配制好的黃芩苷對照品溶液（濃度0.1217 mg/mL），按“1.4.1項”色譜條件在色譜儀中連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定，記錄色譜圖，考察黃芩苷對照品峰面積的變化情況。

1.4.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批號的加味消毒飲顆粒（批號：2020401）1 g，按“1.4.3項”下供試品溶液制方法制備加味消毒飲顆粒供試品溶液，分別于配制后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入HPLC儀中進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積，考察加味消毒飲顆粒供試品溶液在放置后峰面積的變化情況。

1.4.5.5 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號的加味消毒飲顆粒（批號：20200401）各6份，按“1.4.3項”下供試品溶液制方法制備加味消毒飲顆粒供試品溶液，按色譜條件進(jìn)行含量測定，計算其結(jié)果。

1.4.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取黃芩苷對照品，加50%甲醇制成濃度為0.3749 mg/mL的對照品溶液；精密稱取9份加味消毒飲顆粒（批號：20200401，黃芩苷含量為5.0108 mg/g）0.5g，依次精密加入濃度為0.3749 mg/mL 的對照溶液適量，各3 份，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇至50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按色譜條件測定黃芩苷含量，計算其平均加樣回收率。

1.5 樣品含量測定

分別取不同批號的加味消毒飲顆粒3 批樣品，依法制備供試品溶液，并進(jìn)行測定，計算黃芩苷的含量。

2 結(jié)果

2.1 黃芩的鑒別結(jié)果

黃芩的鑒別結(jié)果見圖1，加味消毒飲顆粒供試品色譜分離良好，斑點較清晰，在與黃芩素和漢黃芩素對照品色譜和黃芩對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的灰褐色斑點，其Rf 值適中，分別為0.4和0.64；陰性對照色譜無對應(yīng)顏色斑點，說明本方法專屬性強(qiáng)。

圖1 黃芩TLC圖

2.2 野菊花的鑒別結(jié)果

野菊花的鑒別結(jié)果見圖2，加味消毒飲顆粒供試品色譜分離較好，斑點較清晰，在與蒙花苷對照品色譜和野菊花對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的青綠色熒光斑點，其Rf 值為0.58；陰性對照色譜無對應(yīng)顏色斑點。

圖2 野菊花TCC圖

2.3 梔子的鑒別結(jié)果

梔子的鑒別結(jié)果見圖3，加味消毒飲顆粒供試品色譜分離良好，斑點清晰，在與梔子苷對照品色譜和梔子對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的褐色斑點，其Rf 值為0.52；陰性對照色譜無對應(yīng)顏色斑點，證明本方法專屬性強(qiáng)。

圖3 梔子TLC圖

2.4 黃芩苷含量測定結(jié)果

專屬性考察結(jié)果中黃芩苷色譜峰分離效果良好，峰形佳，且陰性樣品溶液在相同保留時間處未見干擾（圖4）。在方法學(xué)考察中，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程式Y(jié)=33.604X+2.280，r=0.9998（n=8），結(jié)果表明進(jìn)樣量在0.243～1.946μg之間，進(jìn)樣量與峰面積之間有良好線性關(guān)系。精密度實驗測得黃芩苷峰面積的RSD值為0.79%（n=6），表明該含量測定方法的精密度良好。穩(wěn)定性實驗中黃芩苷峰面積的RSD 值為1.63%，證明該顆粒供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性實驗測得黃芩苷含量為5.0108 mg/g，其RSD值為1.82%，表明該含量測定方法的重復(fù)性良好。加樣回收實驗中，平均加樣回收率為97.30%，RSD為1.78%，表明此含量測定方法的加樣回收率符合要求（表1）。3批加味消毒飲顆粒，其黃芩苷含量分別為5.0108 mg/g，5.1282 mg/g，5.0474 mg/g。

表1 黃芩苷的加樣回收結(jié)果表

圖4 HPLC圖

3 討論

加味消毒飲顆粒含多味中藥，成分較復(fù)雜。筆者曾對組方中的6 味藥材全部進(jìn)行TLC 鑒別研究，以求更全面地對加味消毒飲顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制，但是由于方中山銀花、穿心蓮和蒲公英藥材的層析效果皆不佳，存在組方成分相互干擾的問題，且經(jīng)反復(fù)試驗后仍未達(dá)到TLC鑒別的要求，故不列入加味消毒飲顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

對于組方中黃芩、野菊花和梔子藥材的鑒別，筆者是在前人TLC鑒別方法研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整和創(chuàng)新，且經(jīng)方法學(xué)考察證明，均能適合本顆粒劑的鑒別，可以作為評價加味消毒飲顆粒質(zhì)量的重要手段之一。在研究黃芩的TLC鑒別時，曾參考文獻(xiàn)[9]以甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸（10∶3∶1∶2）溶液為展開劑，但斑點分離不明顯，經(jīng)過實驗調(diào)整，比例為10∶2∶1∶2時結(jié)果斑點分離效果較好。在研究野菊花的TLC時，曾參考2020年版《中國藥典》中野菊花藥材的鑒別方法，先以乙酸乙酯∶丁酮∶三氯甲烷∶甲酸∶水（15∶15∶6∶4∶1）作為展開劑，但展開時斑點稍有堆積，不清晰；后將其比例調(diào)整為（15∶15∶8∶4∶1），則斑點分離效果較好。在研究梔子的TLC 鑒別中，參考了文獻(xiàn)[10]以醋酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水（5∶5∶0.5∶0.5）為展開劑展開，發(fā)現(xiàn)斑點不清晰；經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，以氯仿∶甲醇∶水∶甲酸（7∶3∶0.5∶0.05）為展開劑，結(jié)果斑點清晰。

黃芩是與本制劑作用功效密切相關(guān)的君藥，而黃芩苷作為黃芩主要的活性成分之一，具有顯著的抗炎、抑菌和抗病毒等藥理作用[11]。本實驗以HPLC 法測定加味消毒飲顆粒劑中黃芩苷的含量，對于本顆粒劑的生產(chǎn)、檢驗、使用和確保療效等方面具有重要意義。經(jīng)參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]和多次試驗，發(fā)現(xiàn)在以甲醇∶水∶磷酸（48∶52∶0.1）時峰型最好，峰面積合適，且與雜峰分離效果較好，均達(dá)到要求。本實驗測得到樣品溶液中的黃芩苷保留時間合適，且與前后雜質(zhì)峰的分離度均大于4，峰型和分離度均良好，符合《中國藥典》規(guī)定。

本實驗對加味消毒飲顆粒中黃芩、野菊花和梔子藥材進(jìn)行TLC 鑒別，斑點清晰，供試品溶液與對照品溶液的斑點對應(yīng)良好，陰性對照無干擾；以HPLC 法測定黃芩苷的含量，分離效果好，峰形良好，保留時間適宜，專屬性強(qiáng)，測定結(jié)果準(zhǔn)確，在規(guī)定時間內(nèi)測定方法穩(wěn)定。本研究中所建立的方法可靠、準(zhǔn)確，操作簡單，可確保產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，保證用藥安全。