薯蕷皂苷對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌纖維化的作用及機制研究*

程 陽，葛晨亮，范奕好，何 燕

（廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是多種心血管疾病發生發展的病理基礎，其主要的特征為成纖維細胞聚集和細胞外基質蛋白的過度沉積，引起心臟功能受損，最終導致心室擴大、心肌細胞肥大和凋亡以及充血性心力衰竭的發生[1-2]。MF的發生機制復雜，心臟組織在炎癥反應、心肌缺血及創傷過程中均可發生MF 的改變[3-4]。研究表明，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors 3，NLRP3）在MF 過程中被廣泛激活，參與了MF 的慢性炎癥過程[5]。NLRP3炎癥小體是炎癥小體家族中與疾病關系最密切且研究最充分的一員，其激活后可促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體（pro-caspase-1）自我剪切為caspase-1，進而促進炎癥因子白介素（IL）-1β和IL-18 的激活和釋放，可誘導或加重MF 進程[6-7]。因此，抑制NLRP3 炎癥小體的過度激活，減少炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放，可有效減輕MF的發生。

薯蕷皂苷（dioscin）是薯蕷科植物的主要成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗血栓形成等作用[8]。研究表明，薯蕷皂苷能有效減輕心肌缺血再灌注損傷、心室重構和心肌肥厚的發生，從而對冠心病、糖尿病性心肌病和心力衰竭等疾病具有改善作用[9-11]。然而，目前對于薯蕷皂苷抗MF 作用及其分子機制研究較少，本研究旨在探究其抗MF的機制，為臨床治療心血管疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 薯蕷皂苷試劑（MCE 公司），鹽酸異丙腎上腺素（Solarbio公司），GAPDH抗體（Abcam 公司），NLRP3 抗體（BIOSS 公司），pro-caspase-1 及caspase-1 p20 抗體（Abmart 公司），IL-1β 抗體（Wanleibio公司），IL-18抗體（Wanleibio公司）。

1.2 實驗動物 雄性SD大鼠24只，6～8周齡，購買自長沙天勤生物公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0014，使用許可證編號：SYXK桂2014-0002，飼養于廣西醫科大學動物實驗中心，適應性喂養7 d，12 h光照、黑暗交替，大鼠可自由進食、飲水。本實驗已獲得廣西醫科大學動物實驗倫理委員會批準。

1.3 MF模型建立及給藥方案 將24只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、薯蕷皂苷低劑量組、薯蕷皂苷高劑量組。模型組和薯蕷皂苷低、高劑量組背部皮下注射異丙腎上腺素（ISO，5 mg/kg·d-1），對照組皮下注射等量生理鹽水，連續給藥10 d，誘導大鼠MF 模型；同時薯蕷皂苷低、高劑量組分別灌胃30 mg/kg·d-1、60 mg/kg·d-1的薯蕷皂苷溶液，連續10 d，對照組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.4 大鼠心臟指數的計算 各組大鼠在末次給藥后稱取體重，使用10%水合氯醛深度麻醉后向大鼠右心室注射生理鹽水，通過心臟搏動將生理鹽水泵入循環到達每個心腔，心臟灌流去除心腔內的殘留血液，處死大鼠后解剖取得大鼠心臟并稱重，心臟指數=心臟重量（mg）/體重（g）。

1.5 大鼠心臟組織蘇木精—伊紅（HE）染色和masson 染色 將大鼠心臟組織固定于10%多聚甲醛中，使用梯度乙醇脫水后石蠟包埋，制成5 μm 的切片，使用HE染色，于光學顯微鏡下觀察切片并采集圖像；行masson 三色染色，顯微鏡下觀察切片并采集圖像，使用Image J 6.0 軟件分析心肌膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF），即膠原纖維面積/總面積。

1.6 免疫組織化學染色法檢測心肌組織膠原蛋白（Collagen）Ⅰ、Collagen Ⅲ、IL-1β、IL-18蛋白的表達 大鼠心臟組織脫蠟至水，使用10%山羊血清于室溫下封閉30 min，將組織分別浸泡于Collagen Ⅰ（1∶200）、Collagen Ⅲ（1∶1 000）、IL-1β（1∶400）、IL-18（1∶400）抗體中4 ℃孵育過夜，經PBS沖洗后加入相應二抗（1∶200）室溫孵育1 h，用二氨基聯苯胺染色后于光學顯微鏡下觀察切片并采集圖像，使用Image J 6.0 軟件分析免疫組化Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、IL-1β、IL-18蛋白的相對表達量，計算各項指標免疫組化DAB染色陽性比例。

1.7 免疫印跡法（Western blotting）檢測NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1 p20蛋白的表達 將低溫保存的心肌組織從-80 ℃冰箱取出，按1∶100比例加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，使用低溫組織研磨儀在4 ℃80 Hz 條件下充分研磨，4 ℃12 000 r/min 10 min 離心取上清液即組織蛋白溶液。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品使用12%的SDSPAGE的分離膠分離，并轉移至PVDF膜上，使用5%的奶粉封閉1.5 h 后用TBST 溶液清洗，隨后分別加入到GAPDH（1∶5 000）、NLRP3（1∶2 000）、pro-caspase-1（1∶1 000）、caspase-1 p20（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后于對應二抗（1∶5 000）中孵育1 h，化學發光顯影后使用Image J 6.0分析條帶灰度，將目的條帶分別與相應GAPDH 進行標準化處理。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0對數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟組織HE、masson 染色結果及心重指數、膠原容積分數比較結果 與對照組比較，模型組MF 面積、心臟指數增加（P＜0.05）；與模型組相比，薯蕷皂苷低、高劑量組MF 面積，心臟指數降低（P＜0.05）；大鼠心肌組織HE染色結果顯示，與對照組比較，模型組炎癥細胞浸潤明顯加重，而薯蕷皂苷低、高劑量組炎癥細胞的浸潤水平較模型組減輕，見圖1。

圖1 masson染色和HE染色檢測薯蕷皂苷對ISO誘導的大鼠MF影響

2.2 各組大鼠心臟組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達結果比較 與對照組比較，模型組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達均增加（均P＜0.05），與模型組相比，薯蕷皂苷低、高劑量組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達量均降低（均P＜0.05），見圖2。

圖2 免疫組化染色檢測Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達量

2.3 各組大鼠心臟組織IL-1β 和IL-18 表達比較結果 與對照組比較，模型組大鼠心肌組織IL-1β、IL-18表達增加（P＜0.05），與模型組相比，薯蕷皂苷低、高劑量組IL-1β、IL-18表達降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 免疫組化染色檢測IL-1β、IL-18相對表達量

2.4 各組大鼠心臟組織NLRP3、pro-caspase-1 和caspase-1 p20 蛋白表達比較 與對照組比較，模型組大鼠心肌組織NLRP3、caspase-1 p20 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與模型組相比，薯蕷皂苷低、高劑量組NLRP3、caspase-1 p20 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；各組間大鼠心肌組織pro-caspase-1蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 Western blotting檢測NLRP3炎癥小體表達量

3 討論

MF 是心血管疾病中較常見的病理改變，臨床中多種心血管疾病均會發生不同程度的MF 表現，如高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、慢性心力衰竭等[12-14]。MF 的基本特征為心臟間質成纖維細胞異常增殖，心肌間質和血管周圍膠原纖維過量蓄積，各型膠原蛋白（如Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ等）比例失調以及分布異常[15]，最終導致心臟發生不可逆的病理改變，引起組織順應性下降和心室擴張，從而加速疾病進程。目前臨床上尚缺少治療MF 的特效藥物，β 受體阻滯劑、血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑、醛固酮受體拮抗劑和鈉—葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑等藥物雖然在一定程度上可以改善心臟功能和心衰患者的預后，但并不能逆轉MF改變[16]。因此，對于抗MF藥物的研發是目前亟待解決的問題之一。

薯蕷皂苷為皂苷類化合物，是薯蕷科植物的重要活性成分，具有良好的抗炎、抗損傷作用。近年研究顯示，薯蕷皂苷對心血管系統也有良好的保護作用，可減少心臟氧化應激損傷和缺血再灌注后心律失常等的發生[17-18]。在本研究中，給予大鼠連續10 d的ISO注射后，其心臟組織膠原容積分數、心臟指數升高，同時Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達增加，而給予薯蕷皂苷處理后可使大鼠心臟組織膠原容積分數、心臟指數降低，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達下降，表明薯蕷皂苷對心肌成纖維細胞的活化和MF有抑制作用。

MF 的機制現在尚未完全闡明，但多項研究表明，其發生過程與炎癥激活密切相關。心肌組織發生缺血、炎癥或創傷時，損傷心肌釋放的促纖維化因子也可激活包括炎癥小體在內的天然免疫，NLRP3炎癥小體也參與其中[19]。NLRP3是炎癥小體家族中重要的一員，在心肌組織中具有較高的表達，其通過凋亡相關斑點蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）與procaspase-1 發生相互結合，促使pro-caspase-1 自我剪切為具有功能的caspase-1，促進炎癥因子IL-1β、IL-18 的成熟和釋放，從而導致心肌炎癥反應和MF 的形成[20]。本研究亦發現，予以ISO 處理后可誘導大鼠MF的發生，與此同時，心肌組織NLRP3、caspase-1 p20 表達增高，IL-1β、IL-18 的釋放增加，表明MF的發生與NLRP3 炎癥小體的激活密切相關。目前大量研究證實，薯蕷皂苷具有抑制NLRP3炎癥小體激活的作用[21-23]。本研究顯示，薯蕷皂苷可逆轉由ISO所致的大鼠心臟組織NLRP3、caspase-1 p20、IL-1β、IL-18 的升高，提示薯蕷皂苷可能通過抑制NLRP3炎癥小體的表達而降低MF的發生。

綜上，薯蕷皂苷可減輕ISO 誘導的大鼠MF，其機制可能與抑制NLRP3 炎癥小體激活相關。薯蕷皂苷可能成為MF 候選治療藥物，具有潛在的臨床應用價值，為心血管疾病的治療提供臨床參考。