TERT沉默對OGD/R誘導的大鼠體外星形膠質細胞損傷的影響及機制*

謝曉云，吳 雙，黃海萍，梁程偉，傅金鳳，王辭嵐，劉競麗

（廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科，南寧 530021）

缺血性腦卒中是由于血管狹窄或閉塞而引起腦組織損傷的重大疾病之一，可導致局灶性神經功能障礙甚至是死亡[1]。星形膠質細胞作為大腦中最豐富的細胞類型，在代謝支持、調節神經遞質、維持血腦屏障以及促進神經發生等方面發揮至關重要的作用[2-4]。研究顯示，腦缺血后，活化的星形膠質細胞可通過多種途徑或機制發揮內源性神經保護作用，包括轉化為神經元[5]、吞噬作用[6]及缺血耐受[7]，使其成為近些年缺血性腦卒中研究的熱點。因此，腦缺血后減少星形膠質細胞的損傷對于神經元保護具有重要意義。

端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶催化的功能部位，是端粒酶活性的關鍵調控因子和限速決定因素。長期以來，對TERT 的研究主要集中在其維持端粒長度。然而，近年來也發現TERT 具有非端粒依賴性功能。TERT參與調控細胞的增殖、凋亡及血管生成，與炎癥、氧化應激和腫瘤代謝等過程緊密相關[8-10]。體內外研究發現，TERT 對腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷所致神經元凋亡具有保護作用[11-12]。課題組前期研究也證實，小腦頂核電刺激可促進TERT的表達，并且TERT能夠保護神經元免受腦缺血再灌注誘導的氧化應激損傷[13]。但目前其對腦缺血后星形膠質細胞的作用及機制尚未闡明。因此，本研究建立TERT 基因沉默的原代大鼠腦皮層星形膠質細胞模型，通過OGD/R來模擬體內腦I/R 損傷過程，探討沉默TERT 對OGD/R 誘導的大鼠體外星形膠質細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；DMEM/F12培養基、DMEM無糖培養基、胎牛血清及胰蛋白酶均購買于美國Gibco 公司；轉染試劑Lipofectamine?RNAiMAX Transfection Reagent（貨號：13778030）及TERT SiRNA 購自于美國賽默飛公司；100×青鏈霉素、CCK-8 試劑盒購自碧云天生物公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自大連美侖公司。TERT 抗體、Bcl-2及Bax抗體購買于美國novus公司，P53抗體、GFAP抗體購自英國Abcam。

1.2 原代星形膠質細胞培養及OGD/R模型的制備

選擇出生48 h內的SD乳鼠，不分雌雄，訂購于廣西醫科大學實驗動物中心。用75%乙醇消毒乳鼠3 min，斷頭取腦后分離出大腦皮層，剝離腦膜和血管，剪碎后0.25%胰蛋白酶消化15 min，過濾、離心、吹打，以合適的密度鋪板于多聚賴氨酸包被過的培養瓶中，每2～3 d換液。培養過程中使用差速貼壁、恒溫搖床法來純化星形膠質細胞。使用培養至第三代的細胞，將原先的培養液（89%DMEM/F12+10%FBS+1%青鏈霉素）更換為DMEM 無糖培養基并置于缺氧小室內，5%O2、95%N2的條件下培養6 h，后將DMEM 無糖培養基更換回原先的完全培養基。繼續培養24 h后收集細胞。

1.3 星形膠質細胞轉染及分組 參照Lipofectamine?RNAiMAX Transfection Reagent 轉染的說明將干擾TERT 表達的SiRNA 轉染星形膠質細胞。以每孔2×105個細胞數接種于6孔板中，待細胞融合至60%～80%時進行轉染，分別制備陰性對照及siRNA TERT 與Lipofectamine?RNAiMAX Transfection Reagent 復合物，將上述復合物滴加到6 孔板的對應孔中，培養48 h后收集細胞。

將細胞隨機分為4 組，即正常生長的星形膠質細胞（Control 組）、糖氧剝奪6 h/復糖復氧24 h（OGD/R 組）、OGD/R+轉染siRNA 陰性對照（OGD/R+Si-Con 組）及OGD/R+干擾TERT 表達的SiRNA（OGD/R+Si-TERT組）。

1.4 細胞免疫熒光 制備無菌細胞爬片并將其置于24 孔板中，同時予多聚賴氨酸包被玻片過夜，然后將細胞接種至24孔板中，密度為3×104個/孔至6×104個/孔，星形膠質細胞經相應處理后予固定、通透、封閉、孵育一抗（GFAP 1∶150、TERT 1∶100）、孵熒光二抗（1∶200）及用含DAPI 的抗熒光猝滅封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。通過Image J 軟件來測定各組雙標陽性細胞的熒光強度。

1.5 CCK-8檢測細胞活力 以每孔8×103個細胞接種至96 孔培養板，每孔的細胞液的體積為100 μL，每組設置5個平行孔。然后按上述的分組進行干預后每孔分別加入10 μL CCK-8 溶液，并于細胞培養箱中繼續孵育2 h。最后通過酶標儀測定各孔吸光度值并統計結果。

1.6 Western blotting（WB）檢測P53、Bcl-2及Bax蛋白的表達 用PBS清洗細胞，加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解后12 000 r/min 離心10 min，收集沉淀上清即為細胞總蛋白質。BCA 法檢測蛋白質濃度。SDS-PAGE 電泳使蛋白分離。250 mA 90-150 min（根據分子量大?。⒌鞍邹D移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉60 min。根據marker 裁剪目的蛋白條帶。將其與相應的一抗放在抗體孵育盒中，4 ℃過夜。實驗中使用的抗體有抗TERT 抗體（1∶500），抗P53 抗體（1∶1 000），抗Bcl-2 抗體（1∶1 000）和抗Bax 抗體（1∶1 000）。4 ℃孵育過夜后，TBST洗膜后使用相應的二抗（1∶10 000）室溫孵60 min，之后洗膜并通過ECL 法顯色，內參蛋白為GAPDH，Image J 軟件對條帶灰度值進行分析。

1.7 星形膠質細胞凋亡測定 收集各組細胞，離心后將細胞重懸于500 μL 緩沖液中，吸取其中的100 μL 至新的EP 管中，隨后加入Annexin V-FITC溶液和PI 溶液各5 μL，混勻，室溫下避光孵15 min。染色孵育后涂片，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件對數據進行分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間均數的比較用單因素方差分析，兩組間的比較運用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 皮層星形膠質細胞GFAP 鑒定 免疫熒光檢測星形膠質細胞標志物GFAP 蛋白的表達情況，見圖1。GFAP 主要表達在細胞質，細胞形態較為完整，狀態良好，可用于后續的實驗要求。

圖1 免疫熒光檢測SD大鼠皮層星形膠質細胞GFAP蛋白的表達及定位

2.2 OGD/R 后星形膠質細胞中TERT 熒光定位及表達變化 免疫熒光結果顯示，TERT 在星形膠質細胞的細胞質和細胞核中均有表達，以細胞核為主，細胞質表達較少；與Control 組相比，OGD/R 組星形膠質細胞中TERT的表達増加，且TERT在細胞核及細胞質中的表達均升高（t=6.69,P＜0.05），見圖2。

圖2 星形膠質細胞中TERT熒光的表達變化及細胞定位

2.3 TERT蛋白在星形膠質細胞中的表達水平

與Control組比較，TERT蛋白在OGD/R組表達增加（P＜0.05）；將TERT-siRNA 轉染星形膠質細胞，WB 檢測轉染后4 組TERT 蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與OGD/R+Si-Con 組比較，OGD/R+Si-TERT 組TERT 蛋白表達低于OGD/R+Si-Con 組（P＜0.05），表明使用siRNA 敲低星形膠質細胞TERT成功，見圖3。

圖3 WB檢測TERT蛋白在星形膠質細胞中的表達

2.4 抑制TERT表達對星形膠質細胞活力的影響

CCK-8 結果顯示，與Control 組相比，OGD/R組、OGD/R+Si-Con組及OGD/R+Si-TERT組細胞活力明顯下降（P＜0.05）；與OGD/R+Si-Con 組比較，OGD/R+Si-TERT 組的細胞活力明顯下降（P＜0.05），表明在大鼠星形膠質細胞缺糖缺氧后，沉默TERT可使細胞相對活力明顯下降，加重細胞損傷，見圖4。

圖4 星形膠質細胞在OGD/R 后沉默TERT 對細胞活力的影響

2.5 抑制TERT表達對星形膠質細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI染色結果顯示，僅被綠色熒光染色的為凋亡前期細胞，而同時被綠色和紅色雙染的是凋亡晚期或壞死細胞。與Control 組相比，OGD/R組、OGD/R+Si-Con組及OGD/R+Si-TERT組細胞凋亡明顯增加（P＜0.05）；與OGD/R+Si-Con 組比較，OGD/R 組細胞凋亡無統計學差異（P＞0.05），而OGD/R+Si-TERT組細胞凋亡明顯增加（P＜0.05），見圖5。

圖5 Annexin V-FITC/PI熒光染色檢測星形膠質細胞凋亡

2.6 TERT 沉默對OGD/R 后星形膠質細胞P53、Bax及Bcl-2蛋白的影響 為了進一步研究TERT調節OGD/R 后星形膠質細胞凋亡的機制，對P53/Bcl-2/Bax 凋亡通路進行WB 檢測，結果顯示，星形膠質細胞OGD/R 后Bax、P53 蛋白表達較Control 組升高，Bcl-2蛋白降低（均P＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R+Si-Con組星形膠質細胞的P53、Bax及Bcl-2蛋白相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；與OGD/R+Si-Con組比較，OGD/R+Si-TERT組星形膠質細胞的P53、Bax蛋白相對表達量增加，Bcl-2蛋白表達降低（均P＜0.05）。由此可知，星形膠質細胞缺氧后P53、Bax 的表達增高，Bcl-2 表達降低，下調TERT 后P53、Bax 的表達增高和Bcl-2 表達降低更為明顯，見圖6和圖7。

圖6 TERT沉默增加OGD/R誘導的星形膠質細胞P53、Bax蛋白表達

圖7 TERT沉默減少OGD/R 誘導的星形膠質細胞Bcl-2蛋白表達

3 討論

腦缺血及再灌注損傷涉及一系列復雜的病理過程，包括氧化應激、鈣離子超載、興奮性毒性、炎癥反應和細胞凋亡等。其中，神經細胞凋亡在I/R再灌注損傷機制的研究過程中發揮關鍵作用。課題組前期研究發現，在大鼠腦I/R模型中，小腦頂核電刺激可促進腦組織TERT的表達，增加的TERT對缺血神經元具有保護作用[13]。過去的研究也顯示，在嚙齒類動物及其原代神經元缺血缺氧模型中TERT的表達升高，并且TERT具有促進缺血神經元存活的作用[12,14]。然而，TERT對腦缺血后星形膠質細胞損傷的影響及作用機制未見報道。

因此，在課題組前期研究的基礎上，本研究建立OGD/R 大鼠星形膠質細胞模型，模擬體內腦I/R損傷后星形膠質細胞的病理過程，發現TERT 蛋白在大鼠腦皮層星形膠質細胞OGD/R 模型中表達明顯升高，提示TERT蛋白可能在星形膠質細胞OGD/R損傷的病理過程中發揮關鍵作用。免疫熒光結果表明，星形膠質細胞OGD/R后，TERT蛋白在胞核及細胞質中的表達均明顯增加。這與既往Wu等[15]發現TERT 不僅表達于細胞核中，其在細胞質也有表達的結果基本一致。

既往研究表明，TERT在I/R的過程中能夠抑制不同組織細胞的凋亡。研究顯示，在急性心肌I/R模型中，過表達線粒體TERT對小鼠心肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞凋亡具有保護作用[16]。Zhao等[12]在新生大鼠缺氧缺血模型中發現TERT可能通過抑制caspase-3的激活而發揮抗凋亡作用。同樣，我們的前期研究也發現大鼠腦I/R損傷后小腦頂核電刺激可促進TERT 的表達，并且通過阻止Bax 蛋白由細胞質轉位到線粒體膜而抑制線粒體細胞凋亡途徑[13,17]。因此，為了進一步明確TERT 對OGD/R 后星形膠質細胞凋亡的影響及機制，本研究采用TERT siRNA 沉默TERT 的表達，發現TERT 沉默可明顯增加OGD/R 誘導的星形膠質細胞凋亡及凋亡相關蛋白P53、Bax 的表達，減少細胞活力及凋亡相關蛋白Bcl-2的表達，提示在OGD/R過程中，星形膠質細胞TERT的表達增加是抑制細胞損傷和凋亡的重要原因之一。

在凋亡發生時，Bcl-2家族成員Bcl-2/Bax和P53蛋白發揮了重要的作用。其中Bcl-2在細胞凋亡過程中具有抗凋亡作用，而Bax 及P53 則具有促凋亡作用[18-29]。研究證實P53通過與Bcl-2/Bax相互作用而介導內源性凋亡途徑，維持線粒體功能[20-21]。穩定Bcl-2/Bax的比例可以抑制OGD/R誘導的星形膠質細胞凋亡。P53 蛋白是體內重要的轉錄因子，其與細胞凋亡和DNA 損傷修復緊密相關。本研究WB結果表明，與Control組比較，OGD/R組Bcl-2蛋白表達降低，P53 及Bax 蛋白表達升高；TERT 基因沉默促使OGD/R 后星形膠質細胞內的P53、Bax 蛋白進一步升高，而Bcl-2 蛋白進一步降低。從該研究結果可以推測TERT參與星形膠質細胞的凋亡途徑，TERT 沉默加重OGD/R 大鼠皮層星形膠質細胞的損傷，其機制可能是通過調控P53/Bcl-2/Bax信號通路上的蛋白表達影響細胞活力和凋亡等方式而實現的。

綜上所述，TERT 在大鼠皮層星形膠質細胞OGD/R 處理后表達增加，抑制TERT 表達能促進星形膠質細胞損傷及凋亡，其機制可能與激活P53/Bcl-2/Bax信號通路有關。