基于TLR4信號通路研究利拉魯肽對脂多糖誘導的原代小膠質細胞炎癥反應的作用機制*

楊澤麟，榮 曦，劉 紅

（廣西醫科大學第一附屬醫院老年病學內分泌代謝科，南寧 530021）

利拉魯肽是一種人胰高糖素樣肽-1（GLP-1）類似物，主要通過刺激胰島素分泌和降低胰高血糖素水平來降低血糖水平，臨床用于治療糖尿病[1]。研究發現，利拉魯肽能夠穿越血腦屏障，促進神經元存活、保護神經細胞凋亡、調節神經炎性反應和應激反應，具有很強的抗炎及神經保護作用；并且許多腦內神經元可分泌GLP-1[2]。小膠質細胞是中樞神經系統中一個獨特的細胞群，它是一種多功能細胞，它與中樞神經系統中的很多其他細胞相互作用，包括神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞。大量研究表明，小膠質細胞不僅在中樞神經系統中扮演監視者和旁觀者的角色，更是影響眾多疾病的決定因素，如阿爾茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、多發性硬化癥（MS）、肥胖癥[3-4]。而這些疾病的發生均與炎癥反應密不可分，小膠質細胞在神經系統慢性炎癥的發生、發展中扮演著重要角色[5]。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分，由脂質和多糖構成，可以通過和宿主細胞表面的Toll 樣受體4（TLR4）結合發揮作用。當LPS 與TLR4 結合時，其會通過銜接蛋白—髓樣分化因子88（MyD88）激活絲氨酸/蘇氨酸激酶這種IL-1 受體相關激酶（IRAK）。此外，它還會通過位于IRAK下游的銜接蛋白TRAF6刺激與炎癥反應有關的NF-κB和MAP激酶家族等的活化作用，展現其轉錄活性[6]。本研究旨在通過LPS激活原代小膠質細胞，模擬神經炎癥反應狀態，探索利拉魯肽發揮抗炎及神經保護作用的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM 培養基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；胰蛋白酶（Solarbio）；D-Hanks（Meilunbio）；多聚-L-賴氨酸（Solarbio）；Dnase Ⅰ酶（Solarbio）；LPS（Solarbio）；Liraglutide（MCE）；TAK-242（MCE）；Annexin-V PI 細胞雙染凋亡檢測試劑盒（Bestbio）；兔抗IL-1β 單克隆抗體（abcam）；兔抗TNF-α單克隆抗體（abcam）；兔抗TLR4多克隆抗體（Bioss）；兔抗MyD88 多克隆抗體（Bioss）；兔抗TRAF6 多克隆抗體（Bioss）；兔抗GAPDH 單克隆抗體（abcam）；共聚焦顯微鏡（Nikon）。

1.2 原代小膠質細胞培養和提純 取出生1 d SD大鼠（SPF級），用75%酒精浸泡消毒后斷頭；剪開顱骨，取出腦組織置于預冷的D-Hanks 液中。剝離腦膜和血管，在冰上充分剪碎腦組織，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴充分消化20 min。用含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，加入DnaseI酶去除粘性沉淀，1 000 r/min 離心5 min。棄上清后，用完全培養基重懸細胞，接種于培養瓶中（培養瓶提前用多聚-L-賴氨酸包被，使用前PBS 沖洗3 遍），在含5%CO2的37 ℃恒溫細胞培養箱中培養。培養7～9 d 后，培養瓶中形成混合細胞層，底部為星形膠質細胞，小膠質細胞和少量少突膠質細胞生長在星形膠質細胞的頂端。采用手工拍打法分離小膠質細胞，大力拍打培養瓶5～10 min，在顯微鏡下觀察到混合細胞層的上層細胞大部分脫落，收集上清，1 000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀即為小膠質細胞。用含2%胎牛血清的完全培養基重懸細胞，在含5%CO2的37 ℃恒溫細胞培養箱中繼續培養[7]。

1.3 免疫熒光法鑒定原代小膠質細胞 待細胞完全貼壁，棄除培養基，用PBS溶液洗滌2次；加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，再洗滌3 次；使用0.25%Triton 破膜，37 ℃保存10 min 后，再洗滌3 次，封閉30 min。加入熒光一抗Iba-1溶液（1∶100），4 ℃孵育過夜；棄除一抗溶液，PBS洗滌3次；加入DAPI原液染核，避光孵育5 min，再洗滌3次；加入抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察結果。用Image J軟件定量分析3 個隨機視野中Iba-1 標記的細胞占同一視野中細胞總數的百分比，即為小膠質細胞的純度。

1.4 細胞分組及藥物干預 將提純后的小膠質細胞隨機分為5組：空白對照（N）組、LPS組、利拉魯肽（Li）組、LPS+利拉魯肽（LL）組及LPS+TLR4抑制劑（LT）組。N 組不做任何處理，LPS 組用100 ng/mL LPS 干預24 h，Li 組用100 nmol/L 利拉魯肽干預24 h，LL 組用100 ng/mL LPS 干預24 h+100 nmol/L 利拉魯肽干預24 h，LT組用100 ng/mL LPS干預24 h+100 nmol/L TAK-242干預24 h。

1.5 流式細胞儀測定細胞凋亡率 細胞用PBS 洗滌1次，加入0.25%胰酶消化，待細胞變圓且有部分細胞懸浮，即加入培養基終止消化。收集于EP 管中，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。加入4 ℃預冷的PBS 完全重懸細胞，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。沉淀用Binding Buffer 重懸。加入Propidium Iodide，混勻，室溫下避光反應5～15 min,加入Annexin V-FITC。于1 h內上機檢測。

1.6 蛋白質免疫印跡法（Western blotting）檢測各蛋白的表達量 使用蛋白裂解液（按1∶100 加入PMSF）冰上裂解細胞至少30 min，再次超聲裂解細胞后，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，冷卻后-80 ℃保存。配置分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品加入SDS-PAGE 膠，開始電泳。電泳完成后，將蛋白轉至PVDF膜。轉膜結束后，室溫封閉1 h，再用1×TBST 溶液洗膜3 次，每次5 min。分別與IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6 一抗溶液（1∶1 000）孵育過夜，洗脫一抗后與山羊抗兔二抗溶液（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜5 min×3次。LI-COR Odyssey Infrared Imaging System成像。

1.7 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件分析實驗數據，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素ANOVA 檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小膠質細胞純度鑒定 免疫熒光法染色的小膠質細胞（圖1），小膠質細胞的特異性標記蛋白為Iba-1，為紅色染色；DAPI染細胞核，為藍色染色；合并重疊后細胞有著色。小膠質細胞純度為（95.59±1.53）%。

圖1 免疫熒光染色結果（×200）

2.2 流式細胞儀測定各組細胞總凋亡率 與N 組（11.97±1.31）%比較，LPS 組（30.67±0.12）%細胞總凋亡率升高（P＜0.05）。與LPS 組比較，LL 組（19.58±0.20）%和LT 組（17.51±0.40）%細胞總凋亡率呈下降趨勢（P＜0.05），見圖2。

圖2 流式細胞儀測定各組細胞總凋亡率及結果分析

2.3 各組細胞IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達情況 與N組比較，LPS組TLR4、MyD88、TRAF6 和炎癥因子IL-1β、TNF-α 的蛋白相對表達量均增加（均P＜0.05）。與LPS 組比較，LL 組和LT組TLR4、MyD88、TRAF6、IL-1β、TNF-α蛋白相對表達量均下降（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細胞IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達及結果分析

3 討論

在缺血性中風、多發性硬化、亨廷頓舞蹈癥等疾病中，小膠質細胞被慢性激活，從而放大神經元的死亡[8-9]。另外，高脂飲食會誘導星形膠質細胞、小膠質細胞和神經元產生促炎因子，從而導致下丘腦炎癥，這一機制在誘導肥胖中發揮核心作用[10]。因此，小膠質細胞激活的具體機制可能是預防或治療這些神經系統疾病和肥胖癥的關鍵[11]。

利拉魯肽主要通過模擬天然GLP-1 激活體內的GLP-1受體發揮作用。研究發現，利拉魯肽可以降低小膠質細胞活化數量，從而降低其炎癥反應；并通過減少小膠質細胞增生，刺激抗細胞凋亡途徑，從而保護神經細胞[12-14]。

IL-1β具有較強的促炎活性，在炎癥反應和免疫應答方面發揮重要作用；與它類似，TNF-α可以調節多種發育和免疫過程，如炎癥、凋亡、脂質代謝[15]。研究表明，LPS 可以誘導小膠質細胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子，進而促進炎癥反應發生，造成組織損傷[16]。本研究發現，GLP-1 類似物利拉魯肽能下調小膠質細胞促炎因子IL-1β、TNF-α蛋白表達，說明利拉魯肽能減輕小膠質細胞的氧化應激和炎癥反應。

TLR4 信號通路被LPS 激活可以觸發兩個信號級聯反應：第一個信號轉導途徑涉及TIRAP 和MyD88接頭蛋白，第二個信號級聯反應則結合接頭蛋白TRAM 和TRIF[17]。MyD88 是TLR4 信號通路中的關鍵接頭蛋白，在傳遞上游信號和招募下游分子中具有重要作用[18]。腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAF）是一類多功能的細胞內信號轉導因子，TRAF6 能被MyD88 招募，作為一個重要的連接分子調節TLR4 信號通路的轉導[19]。本研究發現，利拉魯肽和TLR4 抑制劑（TAK-242）的干預均能顯著降低TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達和細胞總凋亡率，改善細胞損傷狀態，提示利拉魯肽具有TLR4抑制劑類似作用，能顯著降低TLR4信號通路活性，下調通路關鍵因子表達。綜上，本課題組認為利拉魯肽能通過下調TLR4信號通路中關鍵因子表達抑制LPS 誘導的原代小膠質細胞炎癥反應，并改善細胞凋亡，發揮神經保護作用。

本研究以原代小膠質細胞為研究對象，基于TLR4 信號通路，探究了GLP-1 類似物利拉魯肽在抗炎及神經保護方面的潛在作用機制，為GLP-1類似物應用于神經相關性疾病提供了理論基礎。但炎癥反應受多種受體信號通路共同支配，是一個復雜多樣的過程，本研究僅在細胞培養水平進行基礎研究，證據尚不充分。未來本課題組將進一步聯合動物實驗及臨床研究，繼續探索GLP-1治療神經炎癥的效果及作用機制。