綠原酸干預(yù)HepG2肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的體外研究*

張瀟劍，藍(lán) 利,2，闕 婷，唐立博，楊子葉，唐 深,2△，羅小玲△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2.廣西高校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是一種含有奎寧酸和咖啡酸的縮酚酸，在咖啡、金銀花、綠茶中的含量極為豐富[1]，具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[2-3]。近年來(lái)有關(guān)天然化合物對(duì)腫瘤的治療作用研究越來(lái)越多。有研究表明，CGA可通過(guò)上調(diào)人肺腺癌A549 細(xì)胞抗氧化酶表達(dá)，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的c-Jun NH2 末端激酶、p38激酶和MAPK激酶4的磷酸化，抑制癌細(xì)胞增殖[4]。此外，CGA 可增加小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的比例，減緩乳腺癌生長(zhǎng)，提高存活率，并能抑制癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移[5]。

原發(fā)性肝癌是全球第七大常見(jiàn)的癌癥，是僅次于肺癌的全球第二大致死率的惡性腫瘤，在病因?qū)W和生物學(xué)上具有異質(zhì)性，其中肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型[6]。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由腫瘤細(xì)胞、多種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成，是實(shí)體腫瘤發(fā)生和發(fā)展依賴的特殊組織結(jié)構(gòu)[7-8]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAM）在TME的組成中占有重要地位，可占某些TME細(xì)胞數(shù)量的50%以上。TAM按照功能通常分為兩類，即經(jīng)典激活途徑的M1 與交替激活途徑的M2，M1 和M2 通過(guò)相互轉(zhuǎn)化產(chǎn)生抗腫瘤或促進(jìn)腫瘤發(fā)展兩種相反的作用[9-11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，M2樣TAM與肝癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。近年來(lái)TME中M1與M2型巨噬細(xì)胞的極化穩(wěn)態(tài)平衡規(guī)律是腫瘤研究的熱點(diǎn)，對(duì)腫瘤預(yù)后有重要的意義。本研究通過(guò)誘導(dǎo)人急性單核白血病細(xì)胞THP-1 分化為M0型巨噬細(xì)胞，利用Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建HCC 細(xì)胞HepG2 與M0 共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)TAM的生成，初步研究CGA 對(duì)肝癌相關(guān)TAM 極化的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1細(xì)胞、HepG2細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。CGA（美國(guó)Sigma公司），佛波酯（PMA，美國(guó)Sigma 公司），青霉素、鏈霉素（索萊寶生物技術(shù)公司），RPMI 1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning 公司），RNA 逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑、TRIzol（日本TaKaRa公司），SYBR Green Master（美國(guó)Roche 公司），引物由Invitrogen 公司合成。StepOne 熒光定量PCR 儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均為美國(guó)Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液和MEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 HepG2與M0共培養(yǎng) THP-1細(xì)胞以3.5×105個(gè)/孔接種于12 孔板Transwell 下室，經(jīng)100 mmol/L PMA 刺激48 h 后，細(xì)胞貼壁展開(kāi)活化為M0 型巨噬細(xì)胞[13]。HepG2細(xì)胞以1.8×105個(gè)/孔接種于12孔板Transwell 上室，與M0 共培養(yǎng)誘導(dǎo)TAM，分為4 組：M0組、TAM組、TAM+50 μg/mL CGA組、TAM+100 μg/mL CGA組。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、拍照。Image J 軟件分析各組圓形/類圓形細(xì)胞、長(zhǎng)梭形細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算圓形/類圓形細(xì)胞數(shù)和長(zhǎng)梭形細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)TAM 樣巨噬細(xì)胞活性 用PBS 清洗細(xì)胞，加入40 μL CCK-8（20 μg/mL）和400 μL RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，采用全波長(zhǎng)分光光度計(jì)檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%。As：實(shí)驗(yàn)孔（含有CGA和細(xì)胞的培養(yǎng)基）；Ac：對(duì)照組（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基）；Ab：空白孔（僅有培養(yǎng)基）。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物mRNA 表達(dá) 用TRIzol 提取細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火、延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。β-actin上游引物序列：5’-TCCTCTCCCAAGTC-CACACAGG-3’，下游：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATTC-3’；白介素（IL）-6上游：5’-ACTCACCT-CTTCAGAACGAATTG-3’，下游：5’-CCATCTTTG-GAAGGTTCAGGTTG-3’；IL-10上游：5’-TCAAGGCGCATGTGAACTCC-3’，下游：5’-GATGTCAAACTCACTCATGGCT-3’；CD163上游：CAGCGGCTTGCAGTTTCCTC-3’，下游：5’-TGGCCTCCTTTTCCATTCCAGA-3’；環(huán)氧化酶2（COX-2）上游：5’-GCCATGGGGTGGACTTAAATCATA；下游：CAGGGACTTGAGGAGGGTAGATCA-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2與M0巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后的形態(tài)學(xué)改變

THP-1 細(xì)胞經(jīng)PMA 刺激活化為M0 巨噬細(xì)胞，細(xì)胞由懸浮的球形逐漸貼壁，并轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或類圓形貼壁細(xì)胞，并由透亮變?yōu)榘祷遥慌cHepG2 共培養(yǎng)后M0極化為TAM樣巨噬細(xì)胞，呈圓形/類圓形或梭形，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不規(guī)則細(xì)胞（b、c）數(shù)量增加；共培養(yǎng)72 h后TAM細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，部分細(xì)胞死亡，見(jiàn)圖1。

圖1 HepG2誘導(dǎo)TAM樣巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×20）

2.2 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)TAM樣巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的影響

M0 巨噬細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h、48 h，隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率升高，共培養(yǎng)72 h后細(xì)胞存活率降低，見(jiàn)圖2。因此，選擇48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的共培養(yǎng)時(shí)間。

圖2 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)TAM樣巨噬細(xì)胞存活率的影響

2.3 不同濃度CGA 對(duì)TAM 樣巨噬細(xì)胞活性的影響

分別用25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和200 μg/mL CGA 干預(yù)HepG2 誘導(dǎo)的TAM，共培養(yǎng)48 h，在25～100 μg/mL隨著CGA濃度增加，TAM細(xì)胞存活率升高，見(jiàn)圖3。據(jù)此，選擇50 μg/mL、100 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的CGA干預(yù)濃度。

圖3 CGA對(duì)TAM樣巨噬細(xì)胞存活率的影響

2.4 CGA對(duì)TAM樣巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

50 μg/mL、100 μg/mL CGA 干預(yù)HepG2 誘導(dǎo)TAM，共培養(yǎng)48 h，隨著CGA濃度增加，不規(guī)則圓形帶偽足細(xì)胞和梭形細(xì)胞數(shù)量增多，見(jiàn)圖4。

圖4 CGA對(duì)TAM樣巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響（×20）

2.5 各組TAM樣巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因表達(dá)水平比較

與M0 組比較，TAM 組IL-10、CD163、COX-2基因表達(dá)水平升高；與TAM 組比較，CGA 處理后M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、CD163基因表達(dá)水平下降，M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-6、COX-2基因表達(dá)水平上升，且TAM+100 μg/mL CGA 組CD163基因表達(dá)水平高于TAM+50 μg/mL CGA組，見(jiàn)表1。

表1 各組TAM樣巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因表達(dá)水平比較±s，n=3

表1 各組TAM樣巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因表達(dá)水平比較±s，n=3

與M0組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與TAM組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與TAM+50 μg/mL CGA組比較，&P＜0.05。

3 討論

巨噬細(xì)胞在先天免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用，具有顯著的表型異質(zhì)性和功能多樣性。在TME 中，TAM 根據(jù)表型和功能的不同被區(qū)分為M1樣TAM和M2樣TAM兩種特殊類型[10]。研究發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)M1樣TAM向M2樣TAM極化有助于機(jī)體對(duì)抗腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[14]。有學(xué)者將THP-1加藥極化為M1或M2后與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，探究不同類型的TAM對(duì)使用化療藥物的腫瘤細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M2 巨噬細(xì)胞對(duì)依托泊苷誘導(dǎo)的HepG2 和A549 癌細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用，而M1 巨噬細(xì)胞則相反[15]。本研究將THP-1 細(xì)胞活化為M0 巨噬細(xì)胞后與HepG2 細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建體外TAM 模型，結(jié)果顯示，M0型巨噬細(xì)胞極化為TAM后變?yōu)椴灰?guī)則類圓形，不規(guī)則細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)比例增加，該形態(tài)學(xué)變化與結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移瘤病理切片研究中TAM的形態(tài)學(xué)結(jié)果相似[16]；且M2型TAM樣巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、CD163mRNA表達(dá)上調(diào)，同時(shí)TAM中抑制腫瘤進(jìn)展的M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物COX-2mRNA 表達(dá)亦明顯上調(diào)，而IL-6表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果提示，M0 巨噬細(xì)胞與HepG2 共培養(yǎng)48 h后可極化為M2樣TAM。

有研究報(bào)道，CGA 可抑制人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞和HT29 細(xì)胞的增殖；CGA 誘導(dǎo)活性氧的生成并使得細(xì)胞周期阻滯在S 期，抑制這兩種細(xì)胞中ERK的激活從產(chǎn)生抗癌作用[17]。Xue 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)、外惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中，CGA 通過(guò)促進(jìn)STAT1 的激活或抑制STAT6 的激活來(lái)調(diào)節(jié)RAW264.7 巨噬細(xì)胞M2 到M1 的極化，從而抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，50 μg/mL、100 μg/mL CGA 處理TAM 48 h 后，隨著濃度增加TAM 樣巨噬細(xì)胞由不規(guī)則的圓形生出偽足，變成狹長(zhǎng)的梭形，梭形細(xì)胞數(shù)量增多；M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物IL-6、COX-2表達(dá)水平上升，M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物IL-10、CD163表達(dá)水平下降，且100 μg/mL 較50 μg/mL干預(yù)作用更強(qiáng)。以上結(jié)果表明，CGA能抑制M2 型TAM 樣巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，提示CGA 可促進(jìn)體外HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)的M2樣TAM向M1樣巨噬細(xì)胞極化。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建體外HepG2誘導(dǎo)的M2 樣TAM，并用不同濃度CGA 干預(yù)，結(jié)果顯示CGA 可以促進(jìn)肝癌相關(guān)TAM 由M2 樣向M1 樣TAM 極化，提示這可能是CGA 抗肝癌作用機(jī)制之一，為進(jìn)一步研究CGA抗腫瘤機(jī)制提供新的思路。