基于p38MAPK/IL-6信號通路研究青蒿琥酯對2型糖尿病大鼠肝臟的作用*

白碩秋，農(nóng)曉琳，2.3.4△，張思琴，李佳芮

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/附屬口腔醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究自治區(qū)級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021；4.頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），南寧 530021）

2型糖尿病是一種以高血糖為特征的內(nèi)分泌疾病，在全球范圍有較高發(fā)病率[1]。有證據(jù)表明，2 型糖尿病患者往往伴隨全身嚴(yán)重并發(fā)癥，如腎臟疾病、心血管病變以及肝臟損傷等[2-3]。2 型糖尿病所導(dǎo)致的肝臟損傷以肝臟炎性反應(yīng)、非酒精性脂肪肝和肝纖維化等較為常見[4-5]。

青蒿琥酯（artesunate，ART）來自中藥青蒿（Artemisia annua L.），具有較強(qiáng)的藥物功效，近些年被用于抗瘧疾、抗炎、抗病毒以及抗腫瘤研究中[6-7]。有研究表明，ART通過抑制各種炎癥信號通路和下游因子發(fā)揮抗炎效果[8-9]。本課題組前期研究顯示，ART對2型糖尿病大鼠心血管、腎臟、腦組織及唾液腺等有保護(hù)作用，但ART對糖尿病大鼠肝臟的影響尚不清楚[10]。鹽酸二甲雙胍作為2型糖尿病治療的常用藥，其降糖作用已被很多研究所證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察2 型糖尿病大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及形態(tài)學(xué)、纖維化變化，研究磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）在各組大鼠肝臟組織中的表達(dá)情況，探討ART、鹽酸二甲雙胍及二者聯(lián)合用藥對2型糖尿病大鼠的影響及其可能機(jī)制，從而探究是否有作為2 型糖尿病及其肝臟并發(fā)癥治療輔助用藥的可能性，旨在為臨床治療2 型糖尿病肝臟病變提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取60 只SD 雄性大鼠，5～6 周齡，體重（175±25）g，在18～25 ℃下，保持通風(fēng)良好，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)全程符合動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.2 動物分組及構(gòu)建模型 60只SD大鼠被隨機(jī)分為正常對照組（NC組，n=12，普通飼料喂養(yǎng)）和模型組（n=48，高糖高脂飼料喂養(yǎng)）。喂養(yǎng)8周后，對模型組大鼠進(jìn)行腹腔注射鏈脲佐菌素溶液（35 mg/kg，購于Sigma公司），注射后于第3、第7天分別測其空腹血糖，若兩次檢測結(jié)果血糖值均大于11.1 mmol/L，則造模成功[10]。隨后將模型組隨機(jī)分為2型糖尿病組（DM組）、ART干預(yù)組（ART組）、鹽酸二甲雙胍干預(yù)組（MET 組）、ART+鹽酸二甲雙胍聯(lián)合用藥干預(yù)組（ART+MET組），每組12只。對ART組采用ART注射液（50 mg/kg，購于桂林南藥有限公司）灌胃，MET 組采用鹽酸二甲雙胍溶液（150 mg/kg，購于深圳海王藥業(yè)有限公司）灌胃，ART+MET組采用ART注射液（50 mg/kg）+鹽酸二甲雙胍溶液（150 mg/kg）灌胃處理。NC 組及DM 組則給與同體積生理鹽水灌胃，每日1次。

1.3 組織取材和處理 給藥干預(yù)4周，每周測定各組大鼠體重及空腹血糖值，隨后處死大鼠。迅速剖開腹腔取出大鼠肝臟，用干凈刀片進(jìn)行分割，切取規(guī)則小塊肝組織，固定在2.5%戊二醛溶液中，用于電鏡觀察。切取部分組織置于RNA keeper中保存，用于mRNA表達(dá)檢測。其余組織固定于4%多聚甲醛中，包埋切片，妥善保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。實(shí)驗(yàn)過程中對實(shí)驗(yàn)動物的處置遵循國家實(shí)驗(yàn)動物管理保護(hù)條例。

1.4 透射電鏡觀察肝臟的超微結(jié)構(gòu)改變 將固定在2.5%戊二醛溶液中的肝組織置于4 ℃冰箱過夜，第2天取出固定好的肝臟組織進(jìn)行脫水、包埋、雙重染色處理，透射電鏡下觀察并拍攝。

1.5 蘇木精—伊紅（HE）和Masson 染色法分別觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)和纖維化改變 取肝臟石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度酒精水化（100%→95%→85%→75%），蘇木精胞核染色，伊紅細(xì)胞質(zhì)染色，干燥，封片。另取一批切片，使用Masson 染色試劑盒（購于北京索萊寶有限公司）按步驟染色。在顯微鏡下分別觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變及纖維化程度并拍攝。

1.6 免疫組織化學(xué)染色法檢測肝臟組織p-p38 MAPK、IL-6 蛋白表達(dá) 將石蠟切片進(jìn)行脫蠟，水化，抗原修復(fù)，過氧化氫阻斷，山羊血清封閉，隨后分別加入p-p38MAPK、IL-6一抗（稀釋倍數(shù)1∶200，購于Biorbyt公司），4 ℃冰箱過夜。第2天滴加二抗（稀釋倍數(shù)1∶1 000，購于博士德公司），DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，干燥，封片，觀察拍攝。用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算p-p38MAPK、IL-6陽性表達(dá)的平均光密度值（MOD）。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）法檢測肝臟組織p-p38 MAPK、IL-6mRNA表達(dá) 取出RNA keeper 中的肝臟組織，充分研磨，Trizol 法提取各組肝臟組織中的總RNA，測定濃度及純度。隨后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購于Thermo 公司）進(jìn)行cDNA合成。以GAPDH作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物序列如下，GAPDH，上游：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；IL-6，上游：5’-ATTGTATGAACAGCGATGATGCAC-3’，下游：5’-CCAGGTAGAAACGGAACTCCAGA-3’；p-p38MAPK，上游：5’-CAGCTTCAGCAGATTATGCGT-3’，下游：5’-AGCCACTGGTTCATCGTCAG-3’。RT-qPCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃30 s；變 性94 ℃5 s，退火、延伸60 ℃34 s，共40個循環(huán)。采用2-△△CT方法分別計(jì)算p-p38 MAPK、IL-6mRNA相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，符合方差齊條件后，采用單因素方差分析的方法進(jìn)行多組比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重及血糖水平比較 用藥干預(yù)后，NC 組大鼠體重呈緩慢升高，空腹血糖值輕微波動。與NC組相比，DM組大鼠體重隨時(shí)間推移逐漸降低，且下降較為明顯，而空腹血糖值呈逐漸上升的趨勢；與DM組相比，各治療組大鼠空腹血糖值隨時(shí)間推移均有不同程度降低，而體重均有不同程度的上升，見圖1a～b。干預(yù)第4 周末，與DM 組相比，ART 組、MET 組、ART+MET 組大鼠空腹血糖值下降，體重升高（均P＜0.05），見圖1c～d。其中，ART+MET組大鼠空腹血糖值下降接近正常水平。

圖1 各組大鼠體重及血糖水平比較

2.2 各組大鼠肝臟組織超微結(jié)構(gòu)比較 透射電鏡下，NC 組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核圓而規(guī)則，核仁均勻；細(xì)胞質(zhì)可見豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器。DM組可見核膜增厚，胞核變形；線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫脹，變形；細(xì)胞內(nèi)見大量脂滴。ART組、MET組和ART+MET組線粒體損傷程度減輕，腫脹變形情況減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張程度較DM組輕，脂滴較DM組少，其中以ART+MET組改善最明顯，見圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織透射電鏡結(jié)果（×15 000）

2.3 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)及纖維化比較 光鏡下，NC組大鼠肝臟可見清楚肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞呈輻射狀排列，形態(tài)大小正常，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤及脂肪變性；DM組大鼠肝臟細(xì)胞腫脹變形，可見肝竇淤血及廣泛脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤，部分可見壞死灶；ART 組、MET 組和ART+MET 組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度及炎癥細(xì)胞浸潤情況較DM組均有所減輕，ART+MET組改善更為顯著。NC組大鼠中央靜脈見少量藍(lán)色膠原纖維，DM 組大鼠肝組織膠原纖維增多增粗，多處形成不完全纖維間隔，細(xì)胞間也可見膠原纖維；與DM 組相比，ART 組、MET組和ART+MET組藍(lán)色膠原纖維均有所減少，見圖3。

圖3 各組大鼠肝臟組織HE、Masson染色結(jié)果（×400）

2.4 各組大鼠肝臟組織p-p38MAPK，IL-6 蛋白表達(dá)比較 p-p38MAPK表達(dá)呈較強(qiáng)的胞核染色，IL-6表達(dá)呈較強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)染色，均表現(xiàn)為棕黃顆粒。與NC 組相比，DM 組p-p38MAPK、IL-6 蛋白表達(dá)均升高（均P＜0.01）；與DM 組相比，ART 組、MET 組及ART+MET組中p-p38 MAPK、IL-6蛋白表達(dá)均降低（均P＜0.05）；ART+MET組IL-6的表達(dá)低于ART組與MET組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠肝臟組織免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果及p-p38MAPK、IL-6蛋白表達(dá)量比較（×400）

2.5 各組大鼠肝臟組織p38MAPK、IL-6mRNA 相對表達(dá)量比較 與NC 組相比，DM 組大鼠pp38MAPK、IL-6mRNA 相對表達(dá)量升高（P＜0.01），與DM 組相比，ART 組、MET 組及ART+MET 組中p-p38MAPK、IL-6mRNA相對表達(dá)量均下降（均P＜0.01），其中，ART+MET 組中p-p38MAPKmRNA 相對表達(dá)量的下降較ART 組、MET 組更為顯著（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠肝臟組織p-p38MAPK、IL-6 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

有研究證明，鏈脲佐菌素可導(dǎo)致胰島素缺乏和高血糖，從而經(jīng)過一系列反應(yīng)產(chǎn)生肝臟損害[11-12]。其構(gòu)建的2型糖尿病大鼠可模仿人類糖尿病患者的生化、血液指標(biāo)變化以及各項(xiàng)相關(guān)并發(fā)癥[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用注射鏈脲佐菌素來建立2型糖尿病大鼠模型。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，使用濃度為50 mg/kg ART 注射液灌胃降糖效果較好，明顯優(yōu)于其他濃度[10]，故本實(shí)驗(yàn)采用此濃度ART注射液進(jìn)行灌胃干預(yù)。

通過對各組大鼠體重及空腹血糖值的測量，發(fā)現(xiàn)ART、MET 以及ART+MET 聯(lián)合用藥可緩解2 型糖尿病引發(fā)的體重減輕，且均有一定降糖作用，其中ART+MET 聯(lián)合用藥效果最為明顯。通過HE 染色和Masson 染色發(fā)現(xiàn)，DM 組大鼠肝臟細(xì)胞變形，出現(xiàn)廣泛脂肪變性，中央靜脈擴(kuò)張充血明顯，可見炎性細(xì)胞浸潤；膠原纖維增多增粗，形成纖維間隔；電鏡下肝細(xì)胞中大量細(xì)胞器受損。在分別采用ART、MET 以及ART+MET 聯(lián)合用藥后，大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性、炎性反應(yīng)、纖維化及超微結(jié)構(gòu)各類細(xì)胞器均有所改善。說明2型糖尿病大鼠肝臟受損表現(xiàn)在脂肪變性、炎癥反應(yīng)及纖維化程度加重。而ART、MET 以及ART+MET 聯(lián)合用藥在一定程度上可以改善糖尿病大鼠的肝臟損傷，減輕糖尿病大鼠肝臟脂肪變性及纖維化程度。為進(jìn)一步研究其可能的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對各組大鼠肝臟組織中的pp38MAPK及IL-6的蛋白及mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行了分析。

p38MAPK 在肝臟脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝及肝纖維化進(jìn)程中起重要作用[14-17]。受外界刺激后，p38MAPK 被磷酸化激活，由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，可誘導(dǎo)IL-6 等炎性因子的表達(dá)，參與肝臟免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟損傷[18-19]。而炎性因子的產(chǎn)生又可導(dǎo)致進(jìn)一步p38MAPK 活化，使各類細(xì)胞反應(yīng)加劇，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，加重靶器官損害。反之，抑制p38MAPK 通路磷酸化可促進(jìn)體內(nèi)葡萄糖代謝，減少脂肪合成，減輕炎癥反應(yīng)，緩解纖維化進(jìn)程[20-22]。

本結(jié)果顯示，與DM 組相比，ART、MET 以及ART+MET 聯(lián)合用藥干預(yù)組大鼠肝臟組織中pp38MAPK、IL-6 蛋白及mRNA 表達(dá)下調(diào)，其中ART+MET聯(lián)合用藥可使IL-6水平降低接近正常水平。說明2 型糖尿病大鼠肝臟受損與p38MAPK 被磷酸化激活，以及下游炎性因子IL-6的表達(dá)增多有關(guān)，而ART 可通過抑制p38MAPK 磷酸化及IL-6 的表達(dá)，減輕肝臟炎癥反應(yīng)及纖維化，從而發(fā)揮保護(hù)大鼠肝臟的作用，ART+MET 聯(lián)合用藥抑制此通路效果更好。

綜上所述，ART 可緩解2 型糖尿病大鼠肝臟炎性反應(yīng)，改善肝纖維化，且ART+MET聯(lián)合用藥效果更為顯著，其機(jī)制可能與抑制p38MAPK/IL-6 信號通路的表達(dá)有關(guān)。ART 具有抗炎及改善纖維化作用，為臨床上改善2 型糖尿病肝損傷提供新思路。同時(shí)，本研究對于纖維化及炎癥相關(guān)通路的探索比較局限，尚待進(jìn)一步的研究。