秦皮苷對脂多糖誘導的巨噬細胞極化的影響*

韋 虹，蔣春蘭，覃再嫩△，鄭 立△

（1.廣西醫科大學再生醫學與醫用生物資源開發應用協同創新中心，南寧 530021；2.廣西組織器官修復醫用生物材料工程技術研究中心，南寧 530021）

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，參與機體固有的免疫應答和適應性免疫應答反應。越來越多的證據表明，巨噬細胞在炎癥反應發揮了關鍵的作用[1]。巨噬細胞（RAW264.7）的激活狀態和M1/M2比值與炎癥的嚴重程度高度相關，其中M1 巨噬細胞分泌幾種促炎細胞因子，包括白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，可導致基質降解和炎癥發生[2-3]；M2 型巨噬細胞可以分泌一系列抗炎因子，如白細胞介素-10（IL-10），CD206，Arg-1 等來發揮抗炎作用和免疫抑制反應[4]。有研究發現，過度表達的活性氧（ROS）會引起機體內發生氧化應激反應，從而破壞組織穩態，加重炎癥的進展[5-6]，且過量的ROS 也會導致巨噬細胞向M1 型極化，促進炎癥性因子的產生，加劇炎癥[7-8]。因此，清除過量表達的ROS和調控滑膜巨噬細胞的極化狀態，減少有害細胞因子的分泌，可以促進組織修復并延緩炎癥的進程。

秦皮苷提取自秦皮，是秦皮的活性成分，有抗菌、抗炎、抗氧化、鎮痛、抗病毒、抗高尿酸血癥和利尿等功效[9-10]。有研究發現，秦皮苷可以通過降低氧化應激的水平，在體內外均表現出有效的肝保護作用[9]。然而，關于秦皮苷通過調控巨噬細胞極化控制炎癥方面的研究目前仍較少。因此，本文旨在通過體外建立M1 型巨噬細胞極化模型，探討秦皮苷對巨噬細胞M1/M2極化的影響，為秦皮苷治療炎癥方面的應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試劑 秦皮苷（純度≥95%）（麥克林，中國）；胎牛血清、DMEM 培養基（Gibco，美國）；PBS、脂多糖（LPS）、青鏈霉素混合液（100×）、總RNA 提取試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）試劑盒、ROS 檢測試劑盒[二氯二氫熒光素二氫乙酸酯（DCFH-DA）]（索萊寶，中國）；細胞活力檢測試劑盒（CCK-8試劑）（Biosharp，中國）；逆轉錄試劑盒（Fermentas Company，美國）；引物（金開瑞，中國）；鈣黃綠素-A/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）（Sigma-Aldrich，美國）；免疫熒光染料FITC-IgG（博士德，中國）；CD206 一抗、iNOS 一抗（Gibco，美國）；封閉用山羊血清（中杉金橋，中國）；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Solarbio，中國）；1.1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（梯希愛，中國）。

1.1.2 儀器 超凈工作臺（蘇州金燕凈化設備有限公司，中國）；二氧化碳恒溫培養箱、核酸蛋白檢測儀（Thermo Scientific，美國）、全波長酶標儀（Molecular Devices，美國）、ProFlex?PCR 系統（Thermo Fisher Scientific，美國）；離心機（Eppendorf，德國）；正置熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本）；Light-Cycler96實時定量PCR 儀（Roche，瑞士），流式細胞分析儀（BD Accuri C6，美國）。

1.2 DPPH試劑檢測秦皮苷的自由基清除能力

稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液。分別取400 μL不同濃度（0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、160 μg/mL）的秦皮苷溶液，加入400 μL DPPH 溶液，混合均勻，室溫放置30 min 后，10 000 r/min 離心5 min。取上清液于540 nm處測吸光度值，計算秦皮苷的自由基清除能力[自由基清除率=（1－各實驗組的吸光度值/零濃度的吸光度值）×100]。

1.3 細胞培養

小鼠巨噬細胞系RAW264.7 細胞，購自中國科學院細胞庫。細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養基，并置于條件為37oC、5%CO2的細胞培養箱中培養隔天換液，待細胞密度達到90%時即可傳代。

1.4 CCK-8 試劑檢測秦皮苷對RAW264.7 細胞的毒性

RAW264.7 細胞以5×103個/孔的密度種在96孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的秦皮苷溶液（0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、160 μg/mL）孵育24 h，用CCK-8 檢測細胞活力，用全波長酶標儀測定孔板在450 nm處的吸光度值，計算細胞活力（細胞存活率=處理組吸光度值/對照組吸光度值×100）。

1.5 細胞分組與干預

將實驗分為3 組，分別為對照組（未處理）、模型組（LPS）和實驗組（LPS＋秦皮苷），對照組加入完全培養基，模型組加入含10 μg/mL LPS 的完全培養基，實驗組加入含10 μg/mL LPS和20 μg/mL秦皮苷的完全培養基。

1.6 Calcein-AM/PI染色檢測秦皮苷對LPS 誘導的RAW264.7細胞活性的影響

將RAW264.7 細胞以2×105個/孔的密度種于含有爬片的6 孔板上，待細胞貼壁后，加藥處理24 h，棄去培養基，用PBS 洗滌細胞3 次，加入含0.5%Calcein-AM 和2%PI的染色液，并在黑暗條件37oC下孵育5 min。用正置熒光顯微鏡觀察并拍照，用Image J軟件分析各組的活死細胞數，并分別計算各組活細胞比例（活細胞比例=活細胞數/活死細胞總數×100）。

1.7 DCFH-DA 熒光探針檢測RAW264.7 細胞內過氧化氫水平

按照1∶1 000 的比例用無血清培養基稀釋DCFH-DA 熒光探針，使終濃度為10 μmol/L。棄去細胞培養基，加入1 mL DCFH-DA 熒光探針稀釋液，細胞置于37oC 的CO2培養箱中避光孵育20 min，用無血清培養基洗滌3 遍，在正置熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度，用Image J軟件分析熒光強度的平均值。采用流式細胞儀檢測細胞內過氧化氫的定量水平。

1.8 RT-qPCR檢測秦皮苷對LPS誘導的RAW264.7細胞相關基因的表達

根據說明書，使用總RNA 分離試劑盒提取各組樣品中的RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄RNA 樣品為cDNA。使用Light Cycle 96 系統進行DNA擴增，反應條件為：95oC 10 min，變性；95oC 15 min，退火；60oC 60 s，共45 個循環。GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCT方法計算相對基因表達量。每個基因重復3次實驗。基因引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 的引物序列

1.9 免疫熒光染色評估RAW264.7 細胞內CD206和iNOS的表達水平

將RAW264.7 細胞以2×105個/孔的密度接種于6 孔板上，待細胞貼壁后，加藥處理并在37oC、5%CO2的培養箱中繼續培養24 h。棄培養基，PBS 洗滌3 次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS 洗滌3 次，每次2 min。用3% H2O2孵育15 min，PBS 洗滌3 次，每次2 min；然后用封閉用山羊血清處理15 min，倒掉血清，勿洗。分別加入一抗iNOS、CD206（1∶200），并在4oC 冰箱孵育過夜或37oC 冰箱孵育4 h，PBS 洗滌3 次，每次2 min，然后在室溫下加入二抗（anti-goat IgG-FITC，1∶200），在37oC的黑暗條件下孵育1 h，PBS 洗滌3 次，每次2 min 鐘；用DAPI（1 μg/mL）染色，黑暗條件下孵育10 min，PBS洗滌3次，每次2 min。然后用抗熒光淬滅劑封片，最后用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.10 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。定量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較進行單因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩者間線性關系采用趨勢性檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 秦皮苷自由基清除能力檢測

當秦皮苷濃度為20 μg/mL時，其自由基清除率約為34%；隨著秦皮苷濃度的增加，自由基清除率增加（P＜0.001），見圖1。

圖1 DPPH檢測秦皮苷的總抗氧化能力

2.2 秦皮苷對RAW264.7細胞的毒性作用

當秦皮苷的濃度為20 μg/mL 時的細胞活力最好（P＜0.05），見圖2；表明秦皮苷的濃度為20 μg/mL 時RAW264.7 細胞的增殖作用最明顯。因此，將20 μg/mL 作為后續實驗研究的有效濃度。

圖2 秦皮苷對RAW264.7細胞活性的影響

2.3 秦皮苷對LPS 誘導的RAW264.7 細胞活性的影響

與對照組相比，模型組活細胞數目減少，死細胞數目增多，細胞活力降低（P＜0.01）。與模型組相比，實驗組活細胞數目增多，死細胞數目減少（P＜0.01），見圖3。

圖3 Calcein-AM/PI 染色檢測細胞活性

2.4 秦皮苷對RAW264.7 細胞內ROS 的水平的影響

與對照組相比，模型組的細胞熒光強度增強（P＜0.001），而加入秦皮苷處理后，細胞熒光強度下降（P＜0.001），見圖4。同時，進一步通過流式細胞儀檢測細胞內ROS 產生情況，與對照組相比，模型組的ROS含量增加了28.9%，而與模型組相比，實驗組的ROS含量降低了25.7%，見圖5。

圖4 秦皮苷對RAW264.7細胞內ROS的影響

圖5 流式細胞儀檢測RAW264.7細胞內ROS的水平

2.5 秦皮苷調控RAW264.7細胞的極化

與對照組相比，模型組中RAW264.7 細胞iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α和CD86等M1型相關基因表達增加（均P＜0.05）；與模型組相比，實驗組中RAW264.7細胞iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α和CD86表達下降，Arg-1、IL-10和CD206等M2 型相關基因表達增加（均P＜0.05），見圖6。

圖6 秦皮苷對RAW264.7細胞相關基因表達水平的影響

2.6 秦皮苷對LPS 誘導的RAW264.7 細胞相關蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組中M2 型巨噬細胞相關標志物CD206 的染色熒光強度較弱（P＜0.001）；與模型組相比，實驗組細胞熒光強度增強（P＜0.001）；與對照組相比，模型組中M1型RAW264.7細胞相關標記物iNOS的染色熒光強度較強（P＜0.001），與模型組比較，實驗組細胞熒光強度下降（P＜0.001），見圖7。

圖7 免疫熒光染色檢測RAW264.7細胞相關蛋白的表達水平

3 討論

巨噬細胞是吞噬性白細胞，在先天免疫反應中發揮重要作用[11]。由感染、炎癥或損傷引起的組織穩態紊亂會顯著改變組織局部環境，影響巨噬細胞活化狀態和新陳代謝。在持續刺激的情況下，巨噬細胞可被激活并向M1 型極化，這將會促進組織損傷和疾病[12]。秦皮苷是一種香豆素類化合物，是中草藥秦皮的主要成分[10]，已知具有抗炎、抗氧化、抗病毒等作用[9-10]。本文就秦皮苷通過誘導巨噬細胞向M2 極化并抑制巨噬細胞的M1極化來減緩炎癥的進展進行探討，有望通過抗炎和抗氧化的作用減緩炎癥的發生和進展。

秦皮苷具有生物相容性良好的優點，即便較大劑量也不會影響細胞的增殖[13]。Calcein-AM/PI 染色結果顯示，經LPS 處理后的巨噬細胞數量減少，而經秦皮苷處理后的巨噬細胞數量增加，說明秦皮苷對巨噬細胞具有保護作用。有研究發現，ROS在炎癥反應中高表達，通過清除細胞內的ROS 抑制氧化應激，對炎癥的治療起著關鍵的作用[14]。本研究中DPPH結果顯示，隨著秦皮苷濃度的增加，其自由基清除能力逐漸增強，表明其具有良好的總抗氧化能力。由于進入細胞的非熒光DCFH-DA可被細胞內ROS 氧化成熒光DCF，其熒光強度與ROS 水平成正比[15]，因此，利用DCFH-DA 熒光探針可以檢測細胞內的ROS。本研究結果也表明了秦皮苷具有清除巨噬細胞內ROS、抑制氧化應激的作用。

研究表明，在炎癥反應過程中，活化的巨噬細胞分泌相關的細胞因子和趨化因子會促進炎癥的發生和發展[16-18]。因此，抑制炎癥因子的過度表達可以延緩炎癥的進展。本研究發現，經LPS 處理后，巨噬細胞分泌的相關炎癥因子如iNOS、IL-1β、TNF-α、CD86和IL-6表達升高，向M1 型極化并加重炎癥反應。而經秦皮苷處理后，相關炎癥因子表達下降，抗炎因子如Arg-1、IL-10和CD206表達上升，巨噬細胞向M2型極化發揮抗炎作用。同時，巨噬細胞的顯著特征是M1 表型的iNOS 特異性表面受體和M2 表型的CD206 表面受體[19-20]。本研究結果顯示，經LPS 誘導后，M1 型巨噬細胞相關蛋白（iNOS）表達升高，M2 型巨噬細胞相關蛋白（CD206）表達下降，經秦皮苷處理后，M1 型相關蛋白的表達受到抑制，M2型相關蛋白表達升高，這些結果與上述巨噬細胞相關基因表達水平結果一致，說明秦皮苷的處理可以逆轉LPS誘導的不良反應，促使巨噬細胞從促炎M1型向抗炎M2型極化，從而發揮抗炎作用。這些結果都表明了秦皮苷能夠抑制LPS誘導發生的炎癥。

綜上所述，秦皮苷能夠清除細胞內的ROS，降低細胞內的氧化應激反應，同時抑制巨噬細胞向促炎M1 表型極化，并促進其向抗炎M2 表型極化，從而分泌相關抗炎因子發揮抗炎作用，促進炎癥轉歸，但其作用機制有待進一步研究。