微透析法測(cè)定秋水仙堿體外血漿蛋白結(jié)合率及與超濾法比較*

蘇曉丹，覃裕翠#，麥琬婷，陸建媚，韋妍妍，黃秋潔，葉 勇△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑實(shí)驗(yàn)教研室，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001）

秋水仙堿（Colchicine）又名秋水仙素，是從百合科秋水仙球莖和種子中提取的卓酚酮類生物堿，具有抗炎、免疫抑制和抗纖維化作用[1]，臨床常用于防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[2-3]。秋水仙堿自身無(wú)毒，但其代謝產(chǎn)物二秋水仙堿具有極強(qiáng)毒性，易導(dǎo)致許多副作用發(fā)生，包括食欲不振、惡心嘔吐、腹痛腹瀉等[4]；且長(zhǎng)期服用可致使肝腎功能損害，周圍神經(jīng)肌肉病變，骨髓抑制等嚴(yán)重藥源性疾病[5-6]。長(zhǎng)期臨床實(shí)踐表明，即使小劑量也會(huì)引起部分痛風(fēng)患者不耐受，從而限制其臨床的廣泛應(yīng)用。秋水仙堿毒副作用源于結(jié)合微管蛋白形成二聚體，同時(shí)抑制白細(xì)胞活化和遷移。除藥物自身性質(zhì)外，還與其在體內(nèi)吸收、分布和代謝等活動(dòng)有關(guān)。藥物被吸收后，只有與血漿蛋白結(jié)合的游離藥物才能通過(guò)生物膜并作用于靶器官發(fā)揮藥理作用，因此測(cè)定藥物與血漿蛋白的結(jié)合率在新藥研發(fā)及臨床研究中非常重要[7]。通過(guò)研究秋水仙堿的血漿蛋白結(jié)合率，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥、設(shè)計(jì)合理給藥方案具有重要意義，有助于提高藥物安全性。測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率方法有很多，如平衡透析法、微透析法、超濾法、超速離心法等[8]，都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。微透析技術(shù)是一種收集待測(cè)組織細(xì)胞外液游離化合物的分析技術(shù)[9]，主要通過(guò)半透膜有特定相對(duì)分子質(zhì)量截留值[10]來(lái)控制分子量大小達(dá)到透析目的[11]。與傳統(tǒng)超濾法相比，既可實(shí)時(shí)分析[2]，也可體外分析[12]；藥物濃度恒定；測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，在藥代動(dòng)力學(xué)研究中廣泛應(yīng)用[13]。本實(shí)驗(yàn)擬采用微透析法研究秋水仙堿與家兔、大鼠血漿的蛋白結(jié)合率，并與超濾法進(jìn)行比較，同時(shí)驗(yàn)證微透析法能否成為秋水仙堿測(cè)定蛋白結(jié)合率的新方法，為秋水仙堿及其制劑的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)提供理論資料，且為臨床用藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

微透析設(shè)備（Sweden CMA 公司）；微透析探針（MAB 7 Microdialysis Probe，膜外徑0.6 mm，活性透析膜長(zhǎng)度10 mm，分子量截留值為15 ku）；灌注器推進(jìn)泵（CMA 402 Syringe Pump）；LC-15A高效液相色譜議（日本島津香港有限公司）；灌注器（CMA 1.0 mL Exmire Microsyringe，MS-GAN100）；TG16-WS醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；電子天平（梅特勒—多利多，XS205DU）。

1.2 試劑與動(dòng)物

秋水仙堿對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：Q-006-181218）；甲醇（色譜純）；超純水；家兔、SD 大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 桂2014-0002，使用許可證號(hào)：SCXK 桂2014-0003。

1.3 秋水仙堿高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定的方法學(xué)考察

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Welchrom-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水（56∶44）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：352 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 溶液的配制（1）林格氏液溶液的配制：在純水中溶解氯化鈉8.599 1 g，氯化鈣0.147 0 g 和氯化鉀0.298 8 g，置于1 000 mL 容量瓶中，定容、過(guò)濾。濾液超聲脫氣后，即為林格氏液（Ringer's 液），備用。（2）血漿的制備：鼠血漿的制備：SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，體重約200 g，負(fù)壓抗凝管取腹主動(dòng)脈全血，3 500 r/min離心15 min，分離血漿，混合保存（4 ℃）。（3）兔血漿的制備：家兔，耳緣靜脈取血，用肝素抗凝，3 500 r/min 離心15 min，分離血漿，混合保存（4 ℃）。（4）磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的配制：稱取十二水磷酸氫二鈉9.51 g，氯化鈉2.20 g，磷酸二氫鈉1.04 g，至500 mL 容量瓶，加水溶解并稀釋定容，即得pH 7.4 的等滲PBS。（5）對(duì)照品溶液的配制：取秋水仙堿對(duì)照品精密稱定25.0 mg，取pH 7.4 PBS溶于50 mL 容量瓶中，震蕩混勻，定容至刻度。即得500.0 μg/mL秋水仙堿對(duì)照品溶液，低溫儲(chǔ)藏，備用。1.3.3 精密度考察 取對(duì)照品溶液3種濃度15.612 5 μg/mL、49.960 0 μg/mL 和79.936 0 μg/mL 分別在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL。另外，分別在6 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣1 次，每次進(jìn)樣10 μL，考察日內(nèi)和日間精密度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取24.98 mg 秋水仙堿對(duì)照品，置50 mL 容量瓶中，用“1.3.2 項(xiàng)”下林格氏液溶解定容、振搖，即得濃度為499.6 μg/mL 貯備液。稀釋貯備液，得到濃度為0.099 92 μg/mL、15.612 5 μg/mL、31.225 0 μg/mL、49.960 0 μg/mL、79.936 0 μg/mL、99.920 0 μg/mL對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C）比峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 陰性干擾試驗(yàn) 將林格氏液灌滿灌注器中，探針連接微灌注器，半透膜探針?lè)謩e浸于大鼠、家兔空白血漿中，啟動(dòng)灌注泵，調(diào)節(jié)流速（2.5 μL/min），并在該流速下收集透析液（100 μL），進(jìn)樣分析，觀察在該實(shí)驗(yàn)條件下秋水仙堿的保留時(shí)間位置是否有干擾。

1.3.6 反透析法測(cè)定探針體外回收率 在灌注器中灌滿不同濃度秋水仙堿溶液（120 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL），探針連接微灌注器，半透膜探針浸于空白血漿中，啟動(dòng)灌注泵，調(diào)節(jié)流速（2.5 μL/min），每種濃度血漿平衡40 min，每60 min 間隔采樣1 次。每種濃度血漿透析液連續(xù)收集3 份樣品，進(jìn)樣分析。

1.3.7 探針體外回收率穩(wěn)定性考察 測(cè)定蛋白結(jié)合率后，用濃度為125 μg/mL 秋水仙堿溶液灌流探針，將半透膜探針?lè)謩e浸于大鼠、家兔空白血漿中，啟動(dòng)灌注泵，調(diào)節(jié)流速（2.5 μL/min），平衡40 min，每60 min間隔采樣1次，分別連續(xù)收集8份樣品，進(jìn)樣分析。

1.4 超濾膜回收率考察

取“1.3.2項(xiàng)”下秋水仙堿對(duì)照品溶液，稀釋制備低、中、高濃度秋水仙堿PBS溶液，質(zhì)量濃度分別為14.0 μg/mL、50.0 μg/mL、70.0 μg/mL，37 ℃水浴溫育2 h。超濾管中放入300.0 μL溫育對(duì)照品液，8 000 r/min 離心30 min 后超濾。取濾液進(jìn)樣分析，結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線A=25 794C-796.66，r=0.999 6 計(jì)算回收率。

1.5 微透析法測(cè)定秋水仙堿體外血漿蛋結(jié)合率

充分?jǐn)嚢韬幯獫{，灌注器中灌滿林格氏液，探針連接微灌注器，將半透膜探針?lè)謩e浸于不同濃度秋水仙堿溶液（125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL）血漿中。透析時(shí)環(huán)境條件相同，啟動(dòng)灌注泵，調(diào)節(jié)流速2.5 μL/min，平衡40 min。相同條件下，每60 min間隔采樣1次，連續(xù)收集3份樣品，進(jìn)樣分析。

1.6 超濾法測(cè)定秋水仙堿體外血漿蛋白結(jié)合率

分別將120 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL的秋水仙堿對(duì)照品溶液與適量大鼠、兔血漿在37 ℃中水浴2 h，再分別取500 μL 于超濾管中，8 000 r/min 離心30 min，取超濾液進(jìn)行HPLC 分析。每種濃度平行測(cè)定3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，相同濃度下兔鼠體外血漿蛋白結(jié)合率超濾法組與微透析法組比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秋水仙堿HPLC測(cè)定的方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 專屬性考察結(jié)果 在“1.3.1 項(xiàng)”色譜條件下，秋水仙堿的保留時(shí)間在5.5 min 左右，峰形良好，無(wú)雜峰干擾，有較好專屬性，分析可行性高，色譜圖見圖1。

圖1 秋水仙堿、空白血漿HPLC圖譜

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在“1.3.4 項(xiàng)”下以峰面積（A）比對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=25 052C-6 613.6，r=0.999 7，表明秋水仙堿在0.099 92～99.920 0 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 精密度考察結(jié)果 對(duì)照品溶液日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）分別為0.36%、0.85%、0.92%，日間精密度RSD 分別為2.53%、1.74%、1.19%。精密度RSD均小于3.00%，可認(rèn)定精密度考察結(jié)果良好。2.1.4 陰性干擾試驗(yàn)結(jié)果 陰性干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠血漿和家兔血漿經(jīng)過(guò)微透析后，在5.5 min左右的吸收對(duì)秋水仙堿測(cè)定沒(méi)有影響。

2.1.5 探針體外回收率的結(jié)果 采用減量法測(cè)定和計(jì)算探針體外回收率，秋水仙堿體外回收率（RL）。RL=（C2-C1）/C2×100%。C1、C2分別為HPLC測(cè)定透析液中秋水仙堿的濃度和實(shí)驗(yàn)前灌流液含藥林格氏液中秋水仙堿的濃度。結(jié)果在同一流速下，同種血漿RL不隨血漿中藥物濃度的大小改變，穩(wěn)定性好。3種不同濃度血漿RL有一定差異，兔血漿平均回收率為46.43%，大鼠血漿平均回收率為35.46%，見表1、表2。

表1 秋水仙堿家兔、大鼠血漿RL n=3,±s

表1 秋水仙堿家兔、大鼠血漿RL n=3,±s

表2 125 μg/mL秋水仙堿兔、大鼠血漿RL穩(wěn)定性考察n=2,±s

表2 125 μg/mL秋水仙堿兔、大鼠血漿RL穩(wěn)定性考察n=2,±s

2.2 超濾膜回收率考察

秋水仙堿濃度為13.96 μg/mL、52.10 μg/mL、71.44 μg/mL 的回收率分別為（99.53±0.04）%、（99.99±0.13）%、（99.92±0.22）%，平均值為（99.88±0.20）%，超濾膜回收率實(shí)驗(yàn)表明回收率值均大于95%超濾膜對(duì)藥物不存在特異性和非特異性吸凈附，表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確可信。

2.3 超濾法和微透析法測(cè)定的秋水仙堿體外血漿蛋白結(jié)合率

微透析法的血漿蛋白結(jié)合率可由血漿中游離藥物濃度求得，血漿中游離秋水仙堿的質(zhì)量濃度（CY）。CY=CT/RL，CT、RL 分別表示透析液中秋水仙堿濃度和探針RL。血漿蛋白結(jié)合率（%）=（C0-CY）/C0×100%，C0為實(shí)驗(yàn)前含藥血漿中秋水仙堿的實(shí)際濃度。超濾法、微透析法在相同種屬的相同濃度下，低、中濃度秋水仙堿在大鼠血漿中的蛋白結(jié)合率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低、中濃度秋水仙堿在兔血漿中的蛋白結(jié)合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。結(jié)果顯示，相同濃度下的秋水仙堿體外血漿蛋白結(jié)合率在大鼠、兔血漿中使用超濾法和微透析法差異不大，高濃度蛋白結(jié)合率偏低，兔體外血漿蛋白結(jié)合率比大鼠體外血漿蛋白結(jié)合率稍高。

表3 秋水仙堿在超濾法和微透析法中大鼠和家兔體外的血漿蛋白結(jié)合率n=3,±s

表3 秋水仙堿在超濾法和微透析法中大鼠和家兔體外的血漿蛋白結(jié)合率n=3,±s

與超濾法比較，*P＜0.05

3 討論

血漿蛋白結(jié)合率是藥動(dòng)學(xué)的重要參數(shù)之一，影響藥物的作用強(qiáng)度及時(shí)間，并與藥物的相互作用及作用機(jī)制密切相關(guān)[14]。目前MD已逐漸應(yīng)用于血漿蛋白結(jié)合率的研究，半透膜可控制分子量大小達(dá)到透析目的。采集到的樣品則可在高效液相色譜儀等分析儀上直接進(jìn)樣分析，從而可以間接研究藥物的血漿蛋白結(jié)合率，可實(shí)時(shí)分析也可體外分析，具有更高的分析效率，相對(duì)其他方法更有優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)超濾法測(cè)定秋水仙堿體外血漿蛋白結(jié)合率時(shí)，根據(jù)濾液體積及其性質(zhì)，對(duì)溫度、時(shí)間與轉(zhuǎn)速進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在4 ℃和37 ℃下進(jìn)行孵育時(shí)，兩者血漿蛋白結(jié)合率無(wú)明顯差異，因此本實(shí)驗(yàn)采用37 ℃溫育。此外，在30 min時(shí)，秋水仙堿血漿蛋白結(jié)合率最高且耗時(shí)短；在無(wú)蛋白泄漏前提下，依照標(biāo)準(zhǔn)超濾液容積比總血漿容積在0.3～0.6間，故選擇離心轉(zhuǎn)速為8 000 r/min。

超濾法、微透析法在相同種屬的相同濃度下，低、中濃度秋水仙堿在大鼠血漿中的蛋白結(jié)合率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在兔血漿中的蛋白結(jié)合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與種屬差異有關(guān)，且兩種方法高濃度蛋白結(jié)合率偏低，兔體外血漿蛋白結(jié)合率比大鼠體外血漿蛋白結(jié)合率稍高。但微透析法和超濾法結(jié)果差別不大，表明采用微透析法進(jìn)行血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定是可靠的。

兔血漿蛋白結(jié)合率較大鼠血漿高，表明含藥兔血漿的游離藥物濃度比大鼠血漿稍低。可能是秋水仙堿與不同血漿蛋白結(jié)合存在種屬差異，血漿或血清所含蛋白成分組成及含量不同導(dǎo)致的。此外，高濃度秋水仙堿與兩種血漿蛋白結(jié)合率較低，可能是自身藥物結(jié)構(gòu)性質(zhì)造成的，但具體原因待進(jìn)一步考察。兩種方法在測(cè)定秋水仙堿蛋白結(jié)合率結(jié)果沒(méi)有顯著差異，表明采用微透析法進(jìn)行血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定是科學(xué)可行的。

血漿蛋白結(jié)合率的高低不僅與藥物、血漿性質(zhì)有關(guān)，還與回收率有關(guān)。探針RL 的測(cè)定方法有多種，本實(shí)驗(yàn)采用減量法進(jìn)行RL考察。在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，用減量法和增量法測(cè)定探針RL，發(fā)現(xiàn)兩者差別不大，鑒于實(shí)驗(yàn)的方便性，選用減量法完成了所有RL研究。但使用減量法前提是：外界條件相同[15]、實(shí)驗(yàn)環(huán)境一致、灌流速度一定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中同種血漿回收率大小不隨濃度發(fā)生變化，可認(rèn)定回收率與藥物濃度無(wú)關(guān)，與大多數(shù)研究回收率文獻(xiàn)結(jié)果一致。

此外，本研究結(jié)果顯示，不同濃度秋水仙堿的蛋白結(jié)合率有一定差異，特別是在低濃度時(shí)蛋白結(jié)合率相對(duì)較高。提示在低濃度給藥時(shí)該化合物以游離型存在的量相對(duì)較少，在臨床用藥時(shí)應(yīng)予以重視。