轉錄因子EB在病毒性心肌炎B細胞中的表達及機制研究*

盧飛玉，韋 斌，孔 清，黃 凱，伍偉鋒

（廣西醫科大學第一附屬醫院心內科，南寧 530021）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由嗜心肌病毒感染引起的心肌炎癥性疾病，其中以柯薩奇病毒B3（coxsackie virus B3，CVB3）感染最為常見，可導致擴張型心肌病和充血性心力衰竭[1]。本課題組前期研究表明，B細胞在VMC的發生發展中發揮了重要的作用[2-4]。B細胞的生長發育成熟以及穩態維持中均存在自噬依賴性[5]。近期文獻報道轉錄因子EB（TFEB）是一個自噬相關的因子[6]，在多種心血管疾病中均有表達，參與了自噬相關的信號通路傳導[7-8]。但TFEB 在VMC 的B 細胞中表達和其作用機制如何，目前較少見相關報道。因此，本研究通過建立VMC 小鼠模型，檢測VMC 小鼠B 細胞中TFEB的表達和自噬標志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量；并觀察脾臟B細胞（VMC-B細胞）在自噬誘導劑的作用下TFEB 的表達變化及其與自噬的關系，以探討TFEB 在VMC-B 細胞中的表達及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級4 周齡雄性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。本實驗所涉及的實驗動物均通過廣西醫科大學實驗動物倫理學會審批。CVB3 Nancy株由廣西醫科大學附屬微生物學教學研究室提供。小鼠CD19 MicroBeads購自德國Miltenyi Biotec公司，胎牛血清和RPMI 1640培養基購自美國Gibco 公司，海藻糖購自美國Sigma-Aldrich公司，所有一抗均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 VMC 小鼠模型建立與分組 將BALB/c 小鼠隨機分為VMC 組和對照組，每組8 只。VMC 組按既往文獻[3]方法擴增病毒，8 只BALB/c 小鼠腹腔注射含102TCID50 CVB3病毒液的0.1 mL磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），其中含有大約105個空斑形成單位（PFU）。對照組同一天接受相同劑量的PBS。注射病毒的當天被認為是第0 天。存活小鼠于第14 天頸椎脫臼法處死，無菌條件下采集組織。

1.2.2 B 細胞分離與培養 將VMC 小鼠的脾臟切成小塊狀，研磨棒輕輕研磨得到單細胞懸液，并對紅細胞進行裂解。隨后用70 μm 細胞過濾器過濾。使用小鼠CD19 MicroBeads按照制造商的使用說明書（#130-121-301）分離B 細胞，流式細胞儀檢測B細胞純度＞90%。對分離的B 細胞進行培養：B 細胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基中培養，2×106細胞/mL，用白介素（IL-12）（10 ng/mL），anti-IGM（10 μg/mL）和anti-CD40 antibody（5 μg/mL）活化B細胞，隨后分為VMC+Tre組和VMC組，VMC+Tre組培養基中加入自噬誘導劑海藻糖（Trehalose，Tre）（100 μmol/L），VMC 組加入等量PBS。兩組B細胞均在37 ℃、5%CO2條件下培養48 h。

1.2.3 心肌組織病理學檢查 在第14 天取對照組和VMC組小鼠的心肌組織，10%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋，切5 μm 厚片行蘇木精—伊紅（HE）染色，高倍顯微鏡（×400）下觀察心肌炎癥程度，并進行病理積分的計算。鏡下觀察并計算每一個視野中炎性細胞浸潤和心肌組織壞死區的面積總和與整個視野面積的比值，其中無心肌損害為0分，病變＜25%為1 分，病變≥25%～＜50%為2 分，病變≥50%～＜75%為3分，病變≥75%為4分。

1.2.4 免疫印跡分析方法（Western blotting）測定各蛋白含量 將小鼠脾臟B細胞置于含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液（RIPA）中裂解30 min，并進行超聲破碎。4 ℃，12 000 r/min 離心15 min，取上清液。用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測提取蛋白的含量。SDS 聚丙烯酰胺凝膠分離等量蛋白質并轉移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。膜與對應一抗在4 ℃下搖床孵育過夜，其中包括：LC3一抗（1∶1 000）；TFEB一抗（1∶1 000）；GAPDH 一抗（1∶8 000）。隨后用辣根過氧化物酶（HRP）標記的相應的二抗（1∶8 000）室溫孵育1 h，用化學發光溶液顯影膜并成像。使用Image J 軟件進行密度測量。以GAPDH 為內參，使蛋白質條帶密度歸一化。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用Spearman 相關進行相關分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組HE染色及心肌病理積分結果

VMC組小鼠表現為毛發紊亂并局部脫落，體重減輕，活動減少，對應激反應不明顯或易激惹。對照組小鼠無異常表現。HE 染色結果顯示：對照組中未見有炎性細胞浸潤或損傷；VMC組小鼠心肌中可見廣泛的炎性細胞浸潤及壞死（圖1A）。與對照組相比，VMC 組心肌病理積分升高（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 兩組心肌組織HE染色及心肌病理積分結果

2.2 VMC小鼠脾臟B細胞中TFEB、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表達情況

與對照組比較，VMC 組B 細胞中TFEB 蛋白相對表達量、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量均增高，兩組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 兩組B細胞中TFEB、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白的表達水平

2.3 VMC-B 細胞在自噬誘導劑作用下的LC3Ⅱ、LC3Ⅰ和TFEB蛋白的表達情況

與VMC組比較，VMC+Tre組VMC-B細胞中自噬標記物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量、TFEB 的表達均增高（均P＜0.05）（圖3A～3C）。相關性分析結果顯示，VMC+Tre 組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量與TFEB 蛋白相對表達量呈正相關關系（r=0.855，P＜0.05）（圖3D）。

圖3 兩組VMC-B細胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、TFEB蛋白的表達水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量與TFEB蛋白相對表達量的相關性

3 討論

VMC 是一種由病毒感染引起的心肌炎癥性疾病，常見的病原體是CVB3。本研究通過對BALB/c小鼠腹腔注射CVB3 建立VMC 模型[9]。觀察發現，VMC 小鼠出現毛發紊亂甚至脫落，活動減少，體重減輕等表現，對照組無異常表現；心肌HE 染色可見，VMC 組小鼠心肌中可見大量炎癥細胞浸潤甚至局部壞死，與之前報道一致[10]，提示VMC 小鼠模型建立成功。

我們的前期研究表明，B 細胞可通過分泌IL-10、TNF-α、IFN-γ 等細胞因子、提呈抗原、促進T 淋巴細胞分化等作用，在VMC 中發揮著重要作用[2-3,11]。文獻報道，B細胞的生長發育過程中均存在自噬現象[12]。自噬是一種高度保守的自我降解以對抗不良環境的細胞內過程[13]，在去除錯誤折疊或聚集的蛋白質、清除受損的細胞器以及清除細胞內病原體方面發揮著關鍵作用[14]。本研究通過Western blotting 檢測發現，VMC 小鼠脾臟B 細胞中自噬標志物 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量增高，表明VMC小鼠B細胞中存在自噬增強現象。

TFEB 是MiT/TFE 轉錄因子家族中的一員，通過促進溶酶體和溶酶體相關細胞器基因的表達，在溶酶體生物發生和自噬等基本細胞過程的調控中起著關鍵作用[15-17]。TFEB 可通過調節自噬在心血管疾病中發揮保護作用：在動脈粥樣硬化中，TFEB調節巨噬細胞中自噬溶酶體的生物發生，抑制巨噬細胞凋亡和促炎性IL-1β 水平，從而減輕動脈粥樣硬化[18]；此外，巨噬細胞特異性TFEB 過表達，可通過增強自噬減輕心肌梗死后的心肌重構[19]。心肌TFEB信號在心肌蛋白病中受損，而TFEB過表達可通過提高自噬溶酶體活性來保護心肌細胞免受蛋白毒性[8]。本研究結果顯示，與對照組相比，VMC組B細胞中TFEB表達水平增高。為了進一步證明TFEB與自噬的關系，本研究在體外實驗中應用Tre。結果顯示，與VMC 組相比較，VMC+Tre 組VMC-B細胞中的TFEB 表達水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量均增高，說明VMC-B 細胞在自噬誘導劑的作用下自噬增強的同時，TFEB表達量增高。此外，本課題組通過相關性分析發現，加入自噬誘導劑后的VMC-B 細胞中TFEB 蛋白相對表達量與自噬標志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量呈現正相關關系。表明TFEB在VMC-B細胞中的表達與自噬相關，提示TFEB參與了VMC-B細胞自噬的過程。

綜上，VMC 小鼠B 細胞中TFEB 表達水平增強，并與自噬增強相關，提示TFEB 可能參與了VMC小鼠B細胞的自噬過程。