多西環素對角膜瘢痕形成的影響*

周佳欣，鄒文進

（廣西醫科大學第一附屬醫院眼科，南寧 530021）

角膜瘢痕是導致失明的主要原因[1-2]，多種眼科常見病均可能導致角膜瘢痕，包括角膜堿燒傷、感染、炎癥、內眼手術等[3]，一旦角膜愈合過程形成永久性瘢痕，將會影響視力，患者可能需要進行角膜移植，但現在角膜供體非常緊缺，亟待一種可以抑制角膜瘢痕形成的藥物。多西環素是一種常用的抗生素，具有良好的抗炎和抗感染作用[4]，近年來的研究發現，其還可以抑制肺纖維化[5]、心肌纖維化[6]、減輕皮膚瘢痕厚度[7]等，然而其是否可以抑制角膜瘢痕形成鮮有報道，其如何對瘢痕相關因子的產生作用更是尚未闡明。角膜瘢痕形成是涉及炎癥細胞浸潤，多種細胞因子、生長因子合成與分泌，上皮細胞再生，角膜細胞纖維化增生的復雜過程[8]；其中轉化生長因子（TGF-β1）誘導的角膜細胞纖維化是重要因素。本研究通過TGF-β1 誘導角膜細胞分化成角膜肌成纖維細胞，觀察多西環素對體外培養的角膜肌成纖維細胞Collagen Ⅰ和Fibronectin表達的抑制作用，并用大鼠構建角膜堿燒傷模型，觀察多西環素對堿燒傷后形成的角膜瘢痕作用，從體內實驗和體外實驗驗證其抑制角膜瘢痕形成，并探索其深入的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養基、PBS、胎牛血清、青霉素—鏈霉素雙抗（加拿大WISENT 公司）；0.05%胰酶（美國Sciencell 公司）；Ⅰ型膠原酶（美國Gibco 公司）；人重組轉化生長因子TGF-β1（美國Peprotech 公司）；T25 細胞培養瓶（美國Corning 公司）；細胞培養箱（德國Binder 公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測試劑盒（日本Takara 公司）；重組Anti-Vimentin 抗體、重組Anti-Keratin12 抗體（英國Abcam 公司）；羊抗兔IgG H&L、羊抗鼠IgG H &L（英國Abcam 公司）；DAPI、抗熒光淬滅的封片液（中國索萊寶公司）；各種規格移液槍（德國Eppendorf 公司）；多西環素粉末（美國Sigma 公司）；顯微鏡和熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 人角膜原代細胞的分離 收集飛秒激光微小切口基質透鏡取出術（SMILE 術）中取出的角膜基質，放入裝有無菌DMEM/F12 培養基的試管中，4 ℃低溫運輸，4 h 內轉移至無菌工作臺；用含有100 μL/mL 青霉素/鏈霉素的PBS 反復漂洗3 次，然后用眼科剪剪成小塊后放入Ⅰ型膠原酶溶液，放置37 ℃環境中消化1 h；充分消化后，用200 目細胞過濾篩過濾溶液后，1 000 r/min 離心5 min，小心去除上清，然后往裝有細胞沉淀的試管中加入適量的DMEM/F12 培養基（含有10%胎牛血清），混勻后計數種瓶，放入37 ℃、5%CO2濃度的培養箱，靜置培養。

1.3 人角膜細胞的傳代培養和鑒定 用倒置顯微鏡觀察，原代細胞融合度達85%進行細胞傳代，培養基改為DMEM/F12 培養基（含有5%胎牛血清），每2 d換液1次，如融合度到85%即進行傳代。傳到第3 代以后，隨機抽取3 瓶將細胞種到12 孔板，1×104個/孔，當孔板內細胞融合度為60%～70%時，用PBS輕柔漂洗3次，每次5 min；加入1 mL孔4%多聚甲醛固定15 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；加入200 μL 孔0.1%tritonX 100 通透15 min；PBS 漂洗3 次后，加入500 μL/孔BSA 封閉30 min；小心吸去封閉液后，加入Anti-keratin（1∶50）和Anti-Vimentin（1∶500），4 ℃孵育過夜；第2天棄一抗，用PBS漂洗3 次；吸干PBS 加入對應的熒光二抗，羊抗兔IgG H&L（1∶2 000）和羊抗鼠IgG H&L（1∶3 000），避光孵育1 h，棄二抗后用PBS漂洗3次，加入DAPI避光孵育5 min，用PBS漂洗3次后加入抗熒光淬滅的封片液封片到熒光倒置顯微鏡觀察并采集結果。

1.4 人角膜細胞纖維化模型制備和分組 將細胞分為3 組，對照組：正常細胞，不加入任何生長因子和藥物；模型組：在細胞傳代種瓶后，隨即加入5 ng/mL TGF-β1；多西環素組：細胞傳代并加入5 ng/mL TGF-β1 干預后2 h，往培養瓶中加入20 ng/mL 的多西環素溶液（以PBS 為溶液）。將各組細胞放置37 ℃、5%CO2濃度的培養箱中培養48 h。

1.5 RT-qPCR檢測CollagenⅠ和Fibronectin mRNA表達水平 根據Takara 抽提總RNA 試劑盒9767 說明書提取細胞RNA；使用Nano drop 檢測所提取到的RNA 質量，A260/A280 為1.8～2.0 之間，符合實驗要求，將RNA 逆轉錄為cDNA 進行PCR反應。反應條件為：95 ℃30 s預變性；95 ℃3 s，60 ℃34 s，設40個循環，設置3個復孔。引物序列為：GAPDH：上游5’-AGATCCCTCCAAAATCAA-GTGG-3，下游5’-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3’；CollagenⅠ引物：上游5’-TTCTGCAACATGGAGACTGG-3’，下游5’-CGCCATACTCGAACTGGAATC-3’；Fibronectin 引 物：上 游5’-ACTGAGACTCCGAGTCAGCC-3’；下游5’-TTCCAACGGCCTACAGAATT-3’。目的基因相對表達量采用2-ΔΔCT法計算。

1.6 Western blotting 檢測CollagenⅠ和Fibronectin蛋白表達水平 用含有PMSF的RIPA裂解細胞，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白濃度后，進行SDS-PAGE 電泳,轉膜，封閉液封閉1 h，分別使用相應的一抗Tubulin（1∶3 000），Fibronectin（1∶1 000）和Collagen I（1∶1 000）孵育過夜，二抗（Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody，1∶2 000）孵育1 h，使用ECL 法進行顯影。用Image J 測量條帶灰度值，計算相對蛋白表達量。

1.7 動物實驗及分組 本研究選用180～220 g 健康雌性SD 大鼠，飼養在標準動物室條件下[溫度：（24±1）℃；濕度：（50±5）%]，適應1 周。造模前，使用體視顯微鏡檢查眼部情況，排除有眼前段疾病的大鼠；采用隨機數字表法將大鼠分為對照組和多西環素組，每組18 只。模型制備：對大鼠左眼進行角膜堿燒傷造模，遵循以下步驟：首先，用異氟烷全身麻醉，鹽酸丙美卡因滴眼液滴左眼表麻，然后用移液槍吸取2 μL 1 mol/L NaOH 溶液，滴到直徑為2 mm 的濾紙上，將該濾紙放置在角膜中央60 s，造成Ⅲ級堿燒傷,最后使用足量生理鹽水徹底沖洗干凈眼表。沖洗完成后，可見角膜中央形成一圓形灰白色燒灼斑，呈磨玻璃狀，角膜基質水腫，虹膜隱約可見。造模成功后，給予眼液滴眼，對照組用眼液溶媒（除不含多西環素，其余一樣），多西環素組用3 000 ng/mL 多西環素眼液，每天滴眼4 次，直至觀察期末。實驗遵循國家實驗動物管理保護條例。

1.8 大鼠角膜混濁度評分

大鼠造模成功后，每天給予眼藥水滴眼時，觀察角膜恢復情況，并于第3、第7、第14 天在體視顯微鏡下仔細觀察眼前段情況，對角膜混濁度評分并采集照片，評分標準參照Holland 等[9]的標準：0 分：角膜透明無混濁；1 分：角膜輕度混濁,虹膜紋理可見；2分：角膜混濁較重,虹膜紋理不清；3分：角膜混濁進一步加重,但可見瞳孔；4分：角膜完全混濁,看不清瞳孔。

1.9 蘇木精—伊紅（HE）染色觀察大鼠角膜結構變化

大鼠造模成功后，在第3、第7、第14 天隨機處死大鼠，取下眼球，清洗干凈后，放入4%多聚甲醛中固定，依次梯度酒精進行脫水，石蠟包埋，切片，烤片，HE 染色，中性樹膠封片光學顯微鏡觀察，選取目標區域進行拍照，分析。

1.10 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人角膜原代細胞鑒定

免疫熒光結果可見Vimentin（綠色熒光）、DAPI（藍色熒光），未見Keratin（紅色熒光），確定為角膜細胞，見圖1。

圖1 角膜細胞Vimentin和Keratin表達情況（免疫熒光，×100）

2.2 多西環素對TGF-β1 誘導的人角膜細胞纖維化抑制作用

與對照組比較，模型組Fibronectin、Collagen ImRNA及其蛋白表達均增高（P＜0.05）；與模型組比較，多西環素組Fibronectin、Collagen ImRNA 及其蛋白表達均降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組Fibronectin和CollagenⅠ的mRNA及其蛋白表達情況

2.3 多西環素對大鼠角膜混濁度影響

角膜堿燒傷后第3天，兩組大鼠虹膜紋理不清，瞳孔隱約可見，基質水腫，結膜充血，上皮缺損；第7天，兩組大鼠角膜基質水腫均消退，對照組瞳孔不可見，周邊有大量新生血管長入，多西環素組瞳孔可見，虹膜紋理不清，未見明顯新生血管長入；第14天，對照組瞳孔隱約可見，虹膜紋理不清，周邊新生血管長入，多西環素組，除了角膜右下方還有約1 mm×1 mm 大小的角膜斑翳外，整個角膜透亮，瞳孔、虹膜清晰可見，周邊新生血管少，見圖3。角膜堿燒傷后第7、第14 天多西環素組角膜混濁度評分均低于對照組（均P＜0.05），見表1。

表1 大鼠角膜堿燒傷后不同時間點角膜混濁度評分±s

表1 大鼠角膜堿燒傷后不同時間點角膜混濁度評分±s

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖3 大鼠角膜堿燒傷后不同時間點角膜情況

2.4 HE染色觀察大鼠角膜結構變化

角膜堿燒傷后第3 天，可見兩組角膜上皮均有明顯缺損，基質層大量炎癥細胞浸潤，接近上皮層處可見新生血管管腔。此外，對照組角膜基質結構較為紊亂；第7 天，兩組上皮均開始重新生長，基質層炎癥細胞和新生血管減少，而對照組上皮與基質連接疏松，基質結構依然十分紊亂，炎癥細胞比多西環素組更多；第14天，兩組角膜上皮修復，視野內無明顯可見炎癥細胞，對照組基質結構排列比多西環素組紊亂，見圖4。

圖4 大鼠角膜堿燒傷后不同時間點HE染色圖（×200）

3 討論

眼化學性燒傷發生率占眼外傷的11.5%～22.1%，是造成角膜瘢痕的重要原因，而且堿性燒傷因堿能溶解脂肪和蛋白，滲入眼內，會造成眼內組織壞死[10-11]，后果非常嚴重。目前研究認為，異常的愈合反應將會誘發炎癥因子和細胞因子變化，發生一系列異常的級聯反應，引起角膜細胞分化為肌成纖維細胞[12]、晶狀體蛋白生成減少、細胞外基質排列紊亂[13]，最終形成角膜瘢痕。本研究在大鼠角膜堿燒傷實驗中發現，堿燒傷3天后，兩組大鼠均角膜上皮缺損，結膜充血，HE染色可見角膜基質有大量炎癥細胞浸潤，膠原排列紊亂；堿燒傷7天后，多西環素組炎癥細胞少于對照組，并且膠原排列比對照組整齊，提示多西環素可減輕炎癥反應，調節細胞外基質紊亂；堿燒傷14 天后，多西環素組角膜整體透明度比對照組高，僅可見少量斑翳，表明多西環素可以減輕角膜堿燒傷后角膜混濁度。

角膜損傷以后TGF-β1 合成增加會誘導角膜細胞分化為肌成纖維細胞，并促進它增殖，誘導細胞外基質合成增加，是導致角膜纖維化的重要原因[14-16]，Fibronectin和Collagen I是角膜纖維化的重要基因和細胞外基質的重要成分[17-18]。因此，本研究在細胞培養基中加入TGF-β1 構建角膜瘢痕形成的體外模型；實驗結果顯示，TGF-β1能高效誘導Fibronectin和Collagen I表達，而多西環素可以下調Fibronectin和Collagen的表達。多西環素雖然目前作為抗生素使用，但研究發現它具有良好的抗炎作用，且能抑制細胞外基質的異常合成，重塑細胞外基質[19-21]。故推測多西環素通過抑制Fibronectin 異常增殖和CollagenⅠ異常沉積，恢復細胞外基質結構；減輕大鼠角膜堿燒傷后炎癥反應，使膠原恢復正常排列，從而減輕角膜瘢痕。

綜上所述，多西環素可以抑制人角膜細胞纖維化基因的表達，減輕大鼠角膜堿燒傷后角膜的混濁度，促進角膜上皮修復。本研究結果為多西環素用于臨床治療角膜堿燒傷提供了一定的理論基礎和運用依據。