IAV絕對定量PCR構建及其在體外感染巨噬細胞中的實驗研究*

闕 婷，藍 利,2，張瀟劍，袁江浪，孔星星，樊曉暉，張增峰，唐 深,2△，羅小玲△

（廣西醫科大學 1.基礎醫學院；2.廣西高校基礎醫學研究重點實驗室，南寧 530021）

甲型流感病毒（IAV）屬正黏病毒科，是一種能在呼吸道黏膜上皮細胞中增殖，并引起呼吸道感染的單股負鏈RNA病毒[1]。由于病毒基因組具有較高的變異率，導致遺傳抗原漂移和基因重組，使病毒復制能力和宿主致病性及范圍均發生改變，從而實現跨種屬感染和傳播[2-3]。有報道稱，在人類和動物模型中，流感病毒感染宿主導致不良臨床結局通常與促炎細胞因子和趨化因子升高有關，輕者僅表現亞臨床的上呼吸道感染，重者可為致命的下呼吸道感染，并進展為呼吸道窘迫綜合征（ARDS）等多器官衰竭，甚至死亡[4]。

巨噬細胞是感染免疫機制研究中重要的細胞類型[5]。體外人源誘導的巨噬細胞主要包括2 個來源，即外周血單個核細胞（PBMC）和人髓系急性白血病單核細胞（THP-1）。選用人PBMC原代巨噬細胞作為體外模型構建，更能接近人生理狀態，但是其數量難以滿足實驗需求。目前，病原學檢測是IAV 的篩查、確認的重要檢測手段。由于病原分離培養的條件和技術水平高、周期長，病毒量的收獲易受環境和樣本質量的影響，不利于在常規實驗室開展[6]。因此，本研究擬建立實時熒光PCR（RT-qPCR）絕對定量法準確、快速檢測IAV 拷貝數，以THP-1 體外誘導分化為巨噬細胞（Mφ），初步研究IAV 感染Mφ 后的細胞活性和病毒復制水平，為后續研究IAV與宿主固有免疫的相互作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒株

急性單核細胞白血病細胞系THP-1（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。禽源H9N2 流感病毒Qa/GX/3139/2012（H9N2）（簡稱GX3139）為低致病禽流感病毒株，由廣西醫科大學基礎醫學院微生物學教研室張增峰教授課題組饋贈。本研究的病毒感染細胞實驗均在廣西醫科大學微生物二級生物安全實驗室內完成。

1.2 主要試劑

病毒基因組RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉錄試劑（日本TaKaRa）、TRIzol（北京天根）；PUC57 質粒（武漢金開瑞）；SYBR?Green Master（美國Roche 公司）；引物由Invitrogen 公司合成；佛波酯（PMA，美國Sigma）；RPMI1640 培養液、胎牛血清（美國Gibco）；青霉素、鏈霉素（索萊寶生物技術公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞處理與分組 將對數生長期的THP-1細胞經100 nmol/L PMA 刺激48 h 活化為Mφ，設Mφ組和加入不同感染復數（MOI）病毒液的Mφ 感染組。IAV的MOI分別為0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、15和20，共9個感染劑量組。

1.3.2 引物的設計與合成 以IAV-M基因序列（GenBank No：MW103403.1）為模板，選取26～1 007 bp 保守區作為擴增目標，根據定量PCR（SYBR Green 法）引物設計原則，采用Primer 5.0 軟件設計引物，并在NCBI作BLAST序列比對驗證引物特異性，引物序列：IAV-M基因上游：5’-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3’，下游：5’-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3’，擴增產物為155 bp。

1.3.3 標準品質粒構建和稀釋 參考MW103403.1序列由武漢金開瑞生物技術服務有限公司完成基因合成和標準品質粒構建，并在本實驗室完成質粒的轉化、擴增和抽提等。將標準品質粒菌液送深圳華大基因公司做序列鑒定，鑒定結果完全符合設計的重組質粒序列。抽提質粒經ND-2000 核酸檢測儀測定DNA的濃度，以拷貝數（拷貝數/μL）=阿氏常數×質粒濃度（ng/μL）×10-9/片段大小（bp）×660 公式計算DNA拷貝數。確定DNA的拷貝數作為標準品母液。將標準品母液按10倍倍比連續稀釋梯度，依次稀釋成108～102copies/μL 范圍，以此配制絕對定量PCR標準曲線的擴增標準品。

1.3.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 分別使用北京天根Trizol 法提取細胞內病毒RNA 和離心柱方法抽提病毒上清液，分別以500 ng/反應和200 ng/反應模板量，逆轉錄為cDNA，用Step One 熒光定量PCR（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行qPCR擴增檢測流感病毒基因拷貝數。qPCR 反應體系：SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 μL、上游引物和下游引物各1 μL（10 nmol/L）、標準品質粒1 μL（1 ng），ROX 0.4 μL，加雙蒸水至20 μL。PCR 反應條件：95 ℃1 min；95 ℃20 s，56 ℃1 min，共40 個循環。

1.3.5 CCK-8 法檢測巨噬細胞活性 將對數生長期的THP-1細胞以2×104個/孔密度接種于96孔板，經100 nmol/L PMA刺激48h活化為Mφ，加入100 μL不同MOI的IAV病毒液，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育3.5 h。用全自動酶標儀在450 nm波長檢測各孔吸光度（OD）值，計算細胞存活率，即[（OD實驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）]×100%，并確定以105～106TCID50 的病毒濃度作為MOI 感染劑量感染Mφ模型。

1.3.6 建立IAV感染巨噬細胞模型 THP-1細胞以1×106個/孔接種于6 孔板，PMA 誘導分化為Mφ，根據CCK-8 活性結果，選取105～106TCID50 范圍的5個MOI的病毒劑量，作為IAV感染Mφ的體外研究模型，倒置顯微鏡（萊卡公司）觀察細胞形態并拍照，感染24 h后收集培養上清和細胞裂解液。

1.3.7 病毒血凝效價檢測 THP-1細胞以1×106個/孔接種6孔板，PMA誘導分化為Mφ，參考上述MOI的病毒感染量，感染細胞24 h后收集培養上清和細胞裂解液。在96孔U型板內做病毒血凝效價檢測，每孔加50 μL 上清或50 μL 細胞裂解液，各孔加入50 μL 0.6%雞紅細胞懸液，室溫孵育30 min后，觀察紅細胞凝集現象，以+～++++判斷25～100%血凝強度，并讀取結果。結果判定：以出現完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數即為病毒的紅細胞凝集滴度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件分析實驗數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關性分析采用雙變量Pearson 檢驗，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 qPCR方法的建立及驗證

2.1.1 標準曲線的建立 以8 個10 倍稀釋度的標準品質粒：1.33×108copies/μL、1.33×107copies/μL、1.33×106copies/μL、1.33×105copies/μL、1.33×104copies/μL、1.33×103copies/μL、1.33×102copies/μL、1.33×10 copies/μL（擴增曲線1～8）作為模板進行熒光定量PCR 反應：質粒標準品的稀釋度為1.33×10 copies/μL，其CT 值與模板質粒DNA 拷貝數的線性關系不明顯，而檢測下限定義為超過95%概率能夠擴增PCR產物的最低拷貝數。因此，該方法的靈敏度可達到1.33×102copies/μL。

熒光定量PCR 方法的標準曲線，以1.33×108copies/μL、1.33×107copies/μL、1.33×106copies/μL、1.33×105copies/μL、1.33×104copies/μL、1.33×103copies/μL 6 個不同稀釋度的標準品質粒作為模板進行擴增，結果顯示，擴增曲線各稀釋度線性關系R2=0.999，斜率為-3.345（-3～-3.5），擴增效率（Eff）為99%（90%～110%），說明擴增曲線各個稀釋度相關性好，擴增效率達到要求，該方法能夠準確反映病毒載量。該引物溶解曲線的Tm值集中形成一個單尖峰，未發現雜峰或雙峰，說明無引物二聚體和非特異擴增，設計引物符合qPCR要求，見圖1。

圖1 熒光定量PCR標準曲線

2.1.2 重復性 將6個10 倍稀釋度的標準品質粒，分別用上述研究建立的熒光定量PCR 方法重復檢測3 次。結果顯示，標準差（SD）在0.06%～0.16%，變異系數（CV）在0.20%～0.82%，均小于1%，表明該質粒標準品具有較好的重復性和穩定性，見表1。

表1 熒光定量PCR重復性評價n=3

2.2 IAV感染巨噬細胞體外模型構建

2.2.1 CCK-8法檢測24 h IAV感染對巨噬細胞細胞活性的影響 與Mφ 組比較，不同MOI 的IAV 病毒液感染Mφ后，細胞活性下降，且與MOI呈負相關關系（r=-0.992，P＜0.05），見圖2。據此，以MOI=2 和MOI=5組為節點，細胞活性在50%～60%，后續實驗選用5個MOI（0.5、1、2、5、10）感染Mφ模型。

圖2 IAV感染巨噬細胞24 h后的細胞活性

2.2.2 倒置顯微鏡觀察IAV感染巨噬細胞后細胞形態學變化 THP-1 經PMA 刺激活化為Mφ，細胞由漂浮透亮的圓形逐漸貼壁，變為灰色不透亮類圓形細胞，形態不規則呈煎蛋樣。當加入不同MOI（0.5、1、2、5、10）的IAV 病毒液感染Mφ 24 h 后，Mφ 出現輪廓不清晰，邊緣逐漸模糊，胞質內出現大量顆粒，并且隨MOI 增大，折光性強的懸浮細胞增多，細胞病變（CPE）逐漸加重，見圖3。

圖3 IAV感染后巨噬細胞形態學變化（×200）

2.2.3 IAV感染巨噬細胞后病毒復制情況

RT-qPCR 檢測細胞RNA 抽提樣本，結果顯示：與Mφ 組比較，隨著MOI 增大，細胞內病毒M 基因拷貝數增加，核酸拷貝數在1.7×105～4.2×106copies/μL范圍，與Mφ感染組呈正相關關系（r=0.869，P＜0.05），Mφ感染組間進行比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 IAV感染巨噬細胞24 h后胞內M基因拷貝數

RT-qPCR檢測培養上清液RNA抽提樣本，結果顯示：與Mφ組比較，隨著MOI增大，培養上清M基因拷貝數增加，核酸拷貝數在7×102～5.5×103copies/μL范圍，與Mφ感染組呈正相關關系（r=0.990，P＜0.05），見圖5。提示在Mφ內復制的IAV釋放到細胞外，且隨感染病毒量增加，釋放量也增加。

圖5 IAV感染巨噬細胞24 h后上清M基因拷貝數

2.3 血凝實驗檢測IAV 感染巨噬細胞后細胞內和培養上清液的HA效價

IAV 表面的HA 可以凝集雞紅細胞，通常可用病毒血凝實驗檢測雞胚或病毒濃度較高標本的HA效價，以評估病毒的生物復制水平。IAV 感染Mφ 24 h 后，檢測細胞裂解液和上清液的病毒HA 效價。隨著MOI升高，上清液HA效價呈上升趨勢，效價在1∶32～1∶64 范圍，而細胞裂解液的HA 效價在1∶64，并未隨MOI增加而增加。HA效價結果提示，病毒血凝實驗雖然是檢測病毒生物復制水平的金標準，但該方法檢測敏感度較低，無法區分0.5～10 MOI 范圍的IAV 感染Mφ 后病毒復制的變化趨勢，見表2。

表2 不同MOI 感染巨噬細胞24 h 后細胞內和培養上清的HA效價

3 討論

近年來，RT-qPCR 技術應用于傳染病的疾病監測中發揮重要作用[7]。但目前，商品化試劑盒檢測結果只有定性參考，未進行定量檢測[8]。本課題組實驗室自建的熒光定量PCR 反應方法是以絕對定量的病毒拷貝數為判定標準，使用流感病毒M基因的保守序列設計特異性引物，構建含M基因重組質粒的標準品繪制標準曲線。結果顯示RT-qPCR 的標準曲線為Y=-3.345X+38.454，具有良好的線性關系，檢測下限為102copies/μL，10 倍稀釋梯度在103～108區分度良好，CV 低于1%，重復性好，同時檢測結果為定量結果，提示該方法敏感性高、重復性好，可作為一種快速敏感的定量檢測方法。Ni等[9]研究報道，利用絕對定量PCR方法檢測IAV，標準曲線的相關系數達到r2=0.991，CT 值與病毒濃度具有良好的相關性，并且檢測下限102copies/μL，這與本研究結果相似。

巨噬細胞是機體天然免疫細胞，在啟動和控制抗病毒免疫防御中起到核心作用。特別是在流感病毒入侵攻擊宿主細胞后，宿主細胞的模式識別受體（PRRs）識別病原相關分子模式（PAMP），激活NF-?B 信號通路和干擾素系統信號，誘導Ⅰ型干擾素、促炎細胞因子（IL-6、MCP-1）產生，從而發揮抗病毒作用[10-11]。另外，有研究報道巨噬細胞不僅作為流感病毒靶標和儲庫[12]，而且在炎癥微環境條件下具有高可塑性，并極化為不同表型M1/M2[5,13]。為此，本研究通過CCK-8法和RT-qPCR法來初步構建流感病毒感染巨噬細胞體外感染模型。以THP-1細胞為體外研究模型，通過PMA 刺激活化為Mφ，并加入不同MOI的IAV，結果發現與Mφ組相比，隨著MOI 升高，Mφ 活性下降；細胞形態邊緣逐漸模糊，細胞質內出現大量顆粒，導致CPE的改變，并且病變程度與MOI 呈正相關關系；以不同MOI 作為Mφ 體外感染模型的劑量，發現感染細胞內和培養上清液中病毒核酸濃度隨MOI 增大而升高，提示IAV 感染Mφ 后可復制并釋放出子代病毒，并產生細胞病變；IAV 感染Mφ 的復制能力與MOI 呈正相關關系，并與細胞病變程度一致，說明IAV對宿主巨噬細胞具有易感性，能夠入侵巨噬細胞內進行復制增殖并釋放病毒顆粒對細胞造成損傷，并與感染MOI 劑量呈相關性增長。有研究報道，高致病H5N1 和低致病H7N9 在人類單核細胞來源巨噬細胞中比較，發現高致病H5N1 具有極強復制和傳播能力，表明高致病H5N1 病毒具有高毒力的病毒載量，表現多循環感染，能夠在宿主細胞內進行有效復制[14]。此外，Li 等[15]從數學模型評估流感病毒在巨噬細胞的病毒復制的動力學和宿主反應的致病性。這與本研究體外感染模型相似。本研究進一步采用病毒血凝實驗測定HA 效價，評估IAV 感染Mφ 后細胞內和培養上清的病毒生物合成水平，結果顯示，隨著MOI 升高，上清液HA 效價呈上升趨勢，效價在1∶32～1∶64，而細胞裂解液的HA效價在1∶64。HA 效價的結果不能區分病毒復制趨勢，可能是該方法檢測敏感度偏低所致，無法顯示IAV 在Mφ內復制增殖和感染能力。本研究構建的IAV 實時熒光絕對定量PCR 檢測法的特異性和靈敏度較好，并和國外研究者報道一致，結合CPE觀察，能有效檢測和反映IAV在體外感染Mφ后病毒復制和釋放的動態變化。

綜上所述，本研究構建的IAV 實時熒光絕對定量PCR 法特異性高，靈敏度較好，能有效檢測和評估IAV體外感染巨噬細胞后病毒復制的動態變化情況，為后續深入研究流感病毒感染巨噬細胞的分子機制奠定基礎。