不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)2型糖尿病小鼠腸道菌群及短鏈脂肪酸的影響*

韋 薇，張 秋，黃燕鳳，翟 露，劉玉花，馬 翠，黃 山，鐘 鑫，戴 霞△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧 530007；4.北京醫(yī)院，北京 100730；5.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401320）

糖尿病與腸道菌群之間有著密切的聯(lián)系，腸道微生物環(huán)境穩(wěn)定依賴于益生菌占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，致病菌繁殖受到控制。但在糖尿病狀態(tài)下，腸道菌群處于中等失調(diào)的狀態(tài)，腸道內(nèi)的總菌數(shù)量下降，菌群的比例發(fā)生改變，厚壁菌門和變形菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度升高，擬桿菌門和放線菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度降低，糖尿病患者糞便中短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）濃度顯著降低[1-2]。厚壁菌門在促進(jìn)機(jī)體對(duì)食物能量的攝取利用方面發(fā)揮了重要作用[3]。擬桿菌門參與發(fā)酵碳水化合物、多糖、膽汁酸和類固醇代謝，維持腸道正常生理等功能。放線菌中雙歧桿菌屬有酸化腸道內(nèi)環(huán)境、抑制腐敗菌和病原體生長(zhǎng)等作用。變形菌門多數(shù)為致病菌，在腸道內(nèi)含量較少[4]。腸道菌群的結(jié)構(gòu)、數(shù)量以及功能受到多種因素的影響，其中運(yùn)動(dòng)與腸道菌群有著密切的聯(lián)系[5]。運(yùn)動(dòng)不僅能改善糖尿病患者的糖脂代謝，血壓、胰島素抵抗等代謝指標(biāo)，還會(huì)影響人體腸道菌群的組成及代謝[6-7]。目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的研究多為有氧運(yùn)動(dòng)，抗阻運(yùn)動(dòng)及聯(lián)合有氧—抗阻運(yùn)動(dòng)的研究鮮有報(bào)道。據(jù)此，本研究對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行8 周的有氧運(yùn)動(dòng)、抗阻運(yùn)動(dòng)及聯(lián)合有氧—抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)，比較3 種運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠腸道菌群及糞便、血清中SCFA的影響，為運(yùn)動(dòng)改善腸道菌群和治療糖尿病提供新的研究依據(jù)和指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取C57BL/KS.db背景的雄性db/db小鼠40只，8周齡，隨機(jī)血糖≥300 mg/dL，購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件：溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由攝食、飲水。

1.2 主要試劑 Pusion Hot start flex 2×Master Mix，上海儀濤生物；DL2000 DNA Maker，Takara；Gene colour，北京金博益；Qubit dsNDA HS Assay Kit，Invitrogen，Life technologies；Biowest Agarose G-10，BIOWEST；50×TAE Buffer，上海生工；AMPure XT beads，Beckman；E.Z.N.A.?Stool DNA Kit，Omega Bio-Tek；甲醇、乙酸、丙酸，Merck，Darmstadt，Germany；2-乙基丁酸，Sigma-Aldrich；正己烷，上海阿拉丁。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和運(yùn)動(dòng)方案 將40 只小鼠隨機(jī)分為4組，即有氧運(yùn)動(dòng)組（Y組）、抗阻運(yùn)動(dòng)組（K組）、有氧聯(lián)合抗阻運(yùn)動(dòng)組（L 組）和對(duì)照組（D 組），每組10只。D 組無(wú)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，其余各組進(jìn)行為期8 周的運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

具體運(yùn)動(dòng)方案如下：（1）Y 組：采用坡度為0°的八跑道小鼠跑臺(tái)（北京東西儀器科技有限公司，型號(hào):WDW-1）進(jìn)行無(wú)負(fù)重跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，第1 周，小鼠每天運(yùn)動(dòng)30 min，運(yùn)動(dòng)速度10～15 m/min；第2～8周，小鼠每天運(yùn)動(dòng)60 min，運(yùn)動(dòng)速度15 m/min。（2）K組：采用自制的爬梯（長(zhǎng)1 m，坡度為85°）進(jìn)行尾部負(fù)重爬梯訓(xùn)練，每天完成2組，每組3次不同負(fù)重的抗阻運(yùn)動(dòng)，第1周負(fù)重10%體重，第2周負(fù)重20%體重，第3周負(fù)重30%體重，第4周負(fù)重50%體重，第5～8周負(fù)重70%體重。（3）L 組：采取有氧運(yùn)動(dòng)與抗阻運(yùn)動(dòng)間隔進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)方式，周一、周三、周五進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)量及運(yùn)動(dòng)時(shí)間同K 組；周二、周四、周六進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)量及運(yùn)動(dòng)時(shí)間同Y組。

1.4 血糖監(jiān)測(cè) 檢測(cè)小鼠的隨機(jī)血糖值。酒精消毒小鼠尾部末端，待干。取出血糖試紙（強(qiáng)生穩(wěn)豪試紙），插入血糖儀（強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀），無(wú)菌醫(yī)用剪剪取小鼠尾部2 mm，待血液流出，使血液滴入血糖試紙血槽，數(shù)秒后，讀取血糖儀上的血糖數(shù)值并記錄。

1.5 取材 無(wú)菌管收集小鼠糞便并稱重，置于-80 ℃超低溫冰箱凍存。用1%戊巴比妥鈉（100 mg/kg體重）麻醉后進(jìn)行眼靜脈叢取血，頸椎脫臼處死，低溫下1 000 r/min 離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.6 16S rDNA測(cè)序 使用Stool DNA Kit進(jìn)行糞便DNA 提取，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA 進(jìn)行定量，對(duì)糞便細(xì)菌16S rDNA 的V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物為515F（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3’）。PCR 反應(yīng)體系：Pusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各2.5 μL，DNA 模板50 ng，ddH2O 定容至25 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用AMPure XT beads 試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，上機(jī)測(cè)序。

生物信息學(xué)分析：采用FLASH（v1.2.8）軟件，根據(jù)雙端序列的overlap 關(guān)系，將序列拼接（merge）成長(zhǎng)的tag，并將序列上建庫(kù)引入的barcode 和引物序列去除，然后采用vsearch（v2.3.4）過(guò)濾嵌合體。預(yù)處理之后的cleandata使用Vsearch 將序列相似性大于97%的clean tags定為一個(gè)OTU，挑選最佳的centroids（位于幾何中心）序列作為該OTU 的代表序列。使用QIIME（v1.8.0）分析Alpha 多樣性。使用blast 進(jìn)行序列比對(duì)，將OTU 代表序列與RDP（核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)）以及NCBI-16S 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)代表性序列進(jìn)行物種注釋。其他圖片使用R 包（V3.2.5）實(shí)現(xiàn)。

1.7 SCFA 檢測(cè) SCFA 檢測(cè)采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）進(jìn)行檢測(cè)。配制乙酸、丙酸、丁酸的混合溶液后，再依次配制成0.000 1 μL/μL、0.000 7 μL/μL、0.001 4 μL/μL、0.007 1 μL/μL、0.014 3 μL/μL、0.017 9 μL/μL、0.035 7 μL/μL 的濃度梯度，使用7個(gè)濃度的標(biāo)品樣本進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，根據(jù)不同濃度及相應(yīng)濃度下標(biāo)品的相對(duì)峰面積（標(biāo)品峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣本進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本中該物質(zhì)的峰面積計(jì)算出該物質(zhì)在樣本中的含量。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25～P75）]表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Wilcoxon 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠血糖的影響 Y 組、K 組和L 組小鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)8 周后的血糖均低于D 組，Y組、K 組和L 組之間小鼠血糖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)后的血糖比較

2.2 OTU 分布Venn 圖 圖2 列舉了不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠共有以及特有菌種的數(shù)量，4組小鼠共有810種菌種為共有菌種，Y 組特有菌種有59 種，K 組有127種，L組有12種，D組有8種，Y組、K組和L組小鼠的特有菌種數(shù)量均高于D 組，說(shuō)明3 種運(yùn)動(dòng)方式均有提高菌群種類的作用。

圖2 OTU分布Venn圖

2.3 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠腸道菌群多樣性的影響 本研究以chao 1 指數(shù)和shannon 指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)小鼠腸道微生物的Alpha 多樣性，chao1 指數(shù)高，說(shuō)明樣品物種數(shù)目越多，shannon 指數(shù)越大，多樣性越高[8]。運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后，4組小鼠chao 1指數(shù)和shannon 指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），K 組2型糖尿病小鼠的chao 1指數(shù)和shannon指數(shù)高于D組，Y 組chao 1 指數(shù)高于D 組，L 組shannon 指數(shù)高于D組（均P＜0.05）；各運(yùn)動(dòng)組chao 1指數(shù)比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），K 組與L 組shannon 指數(shù)比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠腸道菌群Alpha多樣性比較

2.4 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠門水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響 在門水平上，K 組、Y 組、L 組、D 組小鼠的優(yōu)勢(shì)菌分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），約占97%～98%。K 組、Y 組、L組小鼠腸道放線菌門相對(duì)豐度分別為1.18（0.80～1.20）、0.39（0.24～0.75）、0.57（0.43～0.71），均高于D 組的0.36（0.22～0.61）（均P＜0.05），Y 組小鼠變形菌門的相對(duì)豐度[4.39（2.88～5.85）]低于D 組[9.36（7.38～13.22）]（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠菌群門水平結(jié)構(gòu)的影響

2.5 不同運(yùn)動(dòng)方式下小鼠屬水平上腸道菌群前20種菌屬熱圖分析 經(jīng)過(guò)8周的抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，2 型糖尿病小鼠產(chǎn)SCFA 細(xì)菌羅氏菌屬（Roseburia）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）相對(duì)豐度升高，見(jiàn)圖5。

圖5 不同運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)對(duì)小鼠菌群屬水平的影響

2.6 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)2型糖尿病小鼠糞便SCFA的影響 K 組和L 組糞便乙酸含量高于D 組和Y 組，K 組糞便丙酸含量高于D 組、Y 組、L 組（P＜0.05）；各運(yùn)動(dòng)組糞便丁酸含量均高于D 組（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組糞便中SCFA含量比較ng/mg，±s

表1 各組糞便中SCFA含量比較ng/mg，±s

與D 組比較，*P＜0.05；與Y 組比較，#P＜0.05；與L 組比較，&P＜0.05。

2.7 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠血清SCFA 含量的影響K組、L組血清丁酸含量均高于D組（P＜0.05），但L組與K血清丁酸含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組間血清乙酸、丙酸含量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組血清中SCFA含量比較ng/μL

3 討論

運(yùn)動(dòng)可改善患者的糖脂代謝和胰島素抵抗[9]。有研究對(duì)26例糖尿病患者進(jìn)行為期12周彈力帶抗阻運(yùn)動(dòng)，結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)能明顯改善患者的糖化血紅蛋白、空腹、餐后血糖等指標(biāo)[10]。另有研究報(bào)道，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)比單純有氧運(yùn)動(dòng)更能顯著改善患者的血糖水平，提高生活質(zhì)量[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，3種運(yùn)動(dòng)均可改善2 型糖尿病小鼠血糖水平，但3 種運(yùn)動(dòng)方式在改善血糖水平上的效果無(wú)明顯差異，可能與運(yùn)動(dòng)的時(shí)間、強(qiáng)度及頻率不同有關(guān)。

徐山茸等[12]發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)后在校大學(xué)生OTU數(shù)目增加，提示運(yùn)動(dòng)可以提高物種豐富度。本研究發(fā)現(xiàn)，各運(yùn)動(dòng)組小鼠特有菌種OTU 數(shù)量均增加，說(shuō)明3 種運(yùn)動(dòng)方式均可有效提高菌群種類。2 型糖尿病患者腸道菌群Alpha 多樣性降低，腸道菌群多樣性對(duì)2 型糖尿病的影響主要通過(guò)介導(dǎo)腸道菌群代謝[13]。本研究中，運(yùn)動(dòng)干預(yù)后的小鼠腸道菌群多樣性提高，這與Kern等[14]的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能提升腸道菌群多樣性的結(jié)果相一致，提示運(yùn)動(dòng)能提高腸道菌群的多樣性。

厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門為腸道優(yōu)勢(shì)菌，占總菌群的98%以上[15]。本研究結(jié)果顯示，4組小鼠的優(yōu)勢(shì)菌均分別為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)不會(huì)對(duì)腸道菌群的主要優(yōu)勢(shì)菌的大結(jié)構(gòu)有明顯影響。但是經(jīng)過(guò)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，各運(yùn)動(dòng)組小鼠腸道放線菌門的相對(duì)豐度均上升，有氧運(yùn)動(dòng)還降低小鼠變形菌門的相對(duì)豐度。此外，抗阻運(yùn)動(dòng)顯著提高羅氏菌屬和瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度，羅氏菌屬是產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌[16]。有研究報(bào)道，運(yùn)動(dòng)改善了糖尿病前期患者葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素敏感性，該作用與腸道菌群的改變密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果亦證實(shí)，各運(yùn)動(dòng)組糖尿病小鼠在腸道菌群結(jié)構(gòu)得到改善的同時(shí)，血糖水平也得到顯著改善，提示運(yùn)動(dòng)改善血糖的可能途徑是影響腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)。

研究證實(shí)，SCFA 通過(guò)減少熱量攝入、降低血糖、改善胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)、增加胰高血糖素樣肽-1分泌來(lái)改善2型糖尿病[18]。運(yùn)動(dòng)會(huì)影響人體腸道菌群的組成及代謝，Matsumoto 等[19]最早報(bào)道了運(yùn)動(dòng)會(huì)改變盲腸的微生物組成，并且提高小鼠盲腸中正丁酸鹽濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，3種運(yùn)動(dòng)可提高2型糖尿病小鼠體內(nèi)SCFA 的含量，其中抗阻運(yùn)動(dòng)及聯(lián)合運(yùn)動(dòng)在提高SCFA 水平上的效果優(yōu)于有氧運(yùn)動(dòng)。

綜上所述，有氧運(yùn)動(dòng)、抗阻運(yùn)動(dòng)以及聯(lián)合有氧—抗阻運(yùn)動(dòng)均可改善2 型糖尿病小鼠的血糖水平，運(yùn)動(dòng)可調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，影響SCFA 的水平，運(yùn)動(dòng)改善血糖的另一個(gè)可能途徑是通過(guò)影響腸道菌群的組成、結(jié)構(gòu)及代謝。