免疫層析試紙條信號放大技術研究進展

閆靈芝

（運城學院生命科學系，山西運城 044000）

隨著經濟全球化和食品國際貿易的發展，食品從生產、加工、包裝、運輸、儲存到消費的各個環節均比以往更容易被食源性致病微生物、農藥、獸藥、激素和非法添加物等污染。為了保障人民的健康，食品安全的檢測技術顯得尤為重要。在對食品中有毒有害物質進行檢測時，基于高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）、酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等儀器分析方法，雖然檢測靈敏度較高，結果準確性較好，但是樣品前處理比較繁瑣，檢測時間較長，設備昂貴，需要專業的技術人員操作儀器，因此，不適用于食品安全的現場快速檢測[1]。免疫層析試紙條（Immunochromatographic Test Strip，ICTS）結合了層析技術的分離能力和免疫分析方法的特異性，具有操作簡單、無需專業技術人員、檢測成本較低、檢測快速（測定結果可在10~20 min內進行判定）等特點，特別適用于在實驗室外對大批量食品樣品的快速檢測。然而傳統的基于球狀金納米材料的ICTS，檢測靈敏度相對較低，僅可實現定性和半定量的檢測，因此，依賴于ICTS 的信號放大技術，通過信號放大技術提高ICTS 的檢測靈敏度可滿足當前對食品安全檢測的要求。本文對ICTS 的信號放大策略進行綜述并提出了未來的發展方向，以期為食品安全快速檢測技術的發展提供技術參考。

1 傳統免疫層析試紙條的檢測原理

傳統的ICTS 主要由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜、吸水墊以及PVC 襯板五部分組成，其相互堆疊順序如圖1 所示。在結合墊上固定有球狀金納米材料標記的抗體，硝酸纖維素膜上劃有兩條預先固定免疫試劑的檢測線（test line，T 線）和質控線（control line，C 線），T 線用于判定檢測結果，C 線用于判斷試紙條的有效性。

圖1 免疫層析試紙條的示意圖Fig.1 Schematic diagram of ICTS

傳統基于球狀金納米材料的ICTS 的檢測原理是樣品借助層析作用沿試紙條流動，然后與結合墊上的金標抗體和固定于NC 膜T 線和C 線上的免疫試劑相互作用，從而產生紅色的條帶，用于評估測試結果[2?4]。分為兩種模式：雙抗體夾心法和競爭抑制法。雙抗體夾心法采用一對單克隆抗體，其中一個抗體標記金納米材料，另外一個抗體噴涂于T 線，在有目標物存在的情況下，即可在T 線處形成金納米材料-單克隆抗體1-目標物-單克隆抗體2 的夾心結構，該方法主要用于檢測大分子目標物（蛋白質、病原菌、病毒等），檢測直觀性強，靈敏度高，但是需要開發一對抗體和大分子目標物的不同抗原表位結合，無疑增加了檢測的成本。競爭法則用于具有單一抗原表位的小分子抗原的檢測，如：農獸藥殘留、激素、毒素等。待檢目標小分子物質和噴涂于T 線上的抗原競爭地和納米金標記的抗體相結合。該方法抗體和小分子的親和性對檢測靈敏度的影響很大。兩種模式下結合墊、T 線和C 線固定的免疫試劑及結果判定方法不同，其區別如表1 所示。

表1 夾心免疫層析和競爭性免疫層析的區別Table 1 Difference between sandwich and competitive spherical gold-based immunochromatography assay

2 免疫層析試紙條信號放大方法

2.1 開發本身信號強度高的納米標記材料

球狀金納米材料是ICTS 中最常用的信號標記材料，傳統的ICTS 通常采用30~40 nm 的球狀金納米材料，但是該粒徑范圍的金納米材料發光強度不足，且對抗體的捕獲率不高（＜5%），最終導致試紙條的檢測靈敏度不高[5]。100 nm 的球狀納米金由于具有較高的摩爾消光系數和光強度，被認為是制作試紙條較為理想的粒徑[6]。而當納米金的粒徑過大時，由于存在空間位阻效應和較強的光散射性，會影響試紙條的檢測性能[7]。金納米材料的粒徑雖然對ICTS 的檢測性能有較大影響，但是僅通過優化金納米材料的粒徑并不能滿足對目標物質高靈敏的檢測需求，因此需要合成本身發光強度更高的新型納米標記材料用于試紙條的信號放大。表2 列出了在ICTS 中采用的本身信號強度較高的納米材料，各類方法相較于傳統的基于球狀金納米材料的ICTS 的性能提高情況，檢測目標物和檢測限。

表2 本身信號強度高的納米材料Table 2 Nanoparticles with high signal intensity in ICTS

2.2 納米材料聚集法信號放大技術

單個的納米材料發光強度是有限的，為了增強檢測信號強度，研究者開始探索將納米材料聚集在一起來實現信號增強的目的。第一種使納米材料聚集的方法是借助中間載體，將納米材料大量聚集于該載體上或者被包裹在該載體內，進而形成新的信號標記材料，以該材料作為試紙條的信號標簽，由于其帶有較多的納米材料，納米材料的聚集而使得該標簽具有更強的發光強度，因此在試紙條的檢測過程中可以在測試線上獲得更深的條帶顏色，由此實現放大檢測信號的目的[17]。表3 列出了第一種使得納米材料聚集的方法以實現信號放大目的的ICTS，總結了采用的中間載體、被富集的納米材料、性能提高倍數、檢測目標物及檢測限。

表3 納米材料聚集法實現信號放大的ICTS Table 3 Nanoparticles aggregations method for signal amplification in ICTS

第二種使納米材料聚集的方法是雙層法，即采用一對可特異性結合的物質分別結合納米材料，目前利用的該類物質主要為抗體-抗抗體、生物素和鏈霉親和素（streptavidin，Sa）以及牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）-抗BSA 的抗體，在免疫層析的過程中，利用這些物質之間的相互作用實現納米材料的聚集進而增強檢測信號的發光強度。Chen 等[35]將金納米材料分別標記抗體和抗抗體，免疫層析的進行即可在試紙條測試上形成納米金-抗體-抗抗體-納米金復合物進而實現了金納米材料的聚集，用該方法檢測大腸桿菌O157:H7，對其檢測限為1.14×103CFU/mL。Yan 等[36]則利用抗體和抗抗體之間的相互作用實現了磁性納米材料的聚集，對呋喃唑酮代謝物的檢測限為0.044 ng/mL，和傳統方法相比，靈敏度提高了10 倍。Fang 等[37]將金納米材料分別標記鏈霉親和素和生物素化的單克隆抗體，進而形成納米金-Sa-生物素-抗體-納米金復合物，該方法實現對農藥吡蟲啉的檢測，靈敏度為傳統方法的160 倍。用于試紙條的納米信號標記材料通常會采用BSA來封閉非特異性的結合位點，Zhong 等[38]將金納米材料分別標記單克隆抗體和抗BSA 的抗體，進而形成納米金-抗BSA 抗體-BSA-納米金-單克隆抗體復合物，該方法對食品中的三聚氰胺的檢測限為1.4 ng/mL，檢測靈敏度和傳統方法相比提高了25 倍。雙層法雖然提高了ICTS 的檢測靈敏度，但是繁瑣的雙標記過程增加了試紙條的制備時間，影響試紙條的大規模生產，同時會存在一定的空間位阻效應影響待檢目標物和抗體之間的結合效率，影響檢測結果的重復性。

2.3 應用增強試劑信號放大技術

在ICTS 中通過應用增強試劑之間的相互作用，反應會形成新的金屬而在試紙條的測試線上沉積，金屬的沉積加深了測試線的顏色，進而提高了檢測的靈敏度。目前應用增強試劑放大信號的方法主要有“金增強方法”、“銀增強方法”、“鉑增強方法”以及“銅增強方法”。被稱為“金增強方法”的信號放大策略是利用金增強試劑氯金酸（HAuCl4）和還原劑鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）之間的反應，在試紙條原始的納米金表面形成新的一層金納米顆粒，從而增大金納米材料的尺寸而實現信號放大的目的（圖2a）。與直接合成大粒徑金納米材料信號放大的方法相比，該方法是在常規免疫層析結束后再引入增強試劑繼續增大納米材料的粒徑。因此材料粒徑增大并不會影響抗原抗體的結合效率，不存在空間位阻效應影響反應的靈敏度。Bu 等[39]利用該策略檢測食品中的腸炎沙門氏菌，檢測信號增強了100 倍。銀增強方法是在試紙條金納米材料的催化下，還原劑對苯二酚將銀鹽溶液中的銀離子還原為銀單質，銀單質沉積于原先的金納米材料上，形成銀-金納米復合物，該復合物在試紙條上形成黑色的檢測條帶（圖2b）。與原始的紅色條帶相比，黑色條帶顏色較深，且和試紙條白色的背景對比更加明顯[40]。Yu 等[41]利用該方法檢測伏馬菌素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，對其檢測限分別為2 和40 ng/mL，檢測限和傳統方法相比至少降低了兩倍。Anfossi 等[42]利用銀增強方法檢測食品中的赭曲霉毒素A，靈敏度和傳統方法相比提高了10 倍。雖然上述方法可提高試紙條的檢測靈敏度，但是添加銀增強試劑需要額外的二次操作，因此會延長試紙條的分析時間，為了解決這一問題，Kim 等[43]將銀增強試劑和水溶性的核殼納米纖維相結合，并將該納米纖維置于試紙條檢測線之前，隨著免疫層析過程的進行，銀增強試劑可從纖維中釋放，從而實現一步信號放大的目的，該方法對目標物的檢測靈敏度提高了10倍，但是并不影響分析時間。銅增強方法是利用抗壞血酸將Cu2+還原為金屬銅單質（圖2c），銅單質在測試線上的沉積增強了測試線的顏色[44]。Zhou 等[45]利用該方法對牛奶中的大腸桿菌O157:H7 進行檢測，檢測限可達到6 CFU/mL。鉑增強方法是利用對苯二酚將銀離子還原為金屬銀單質，然后利用抗壞血酸將氯鉑酸（H2PtCl6）中的Pt4+還原為金屬鉑而沉積到測試線上（圖2d），測試線顏色加深使得檢測靈敏度提高，該方法對肌紅蛋白的檢測限為5.47 ng/mL[46]。

圖2 應用增強試劑信號放大技術[39,41,44,46]Fig.2 Signal amplification technology by applying enhanced reagent[39,41,44,46]

應用增強試劑的信號放大技術雖然提高了試紙條的檢測靈敏度，但是添加增強試劑通常是在常規免疫層析之后進行的二次操作，會增加試紙條的分析時間，影響檢測效率。因此一步法實現信號放大的技術是未來研究的重點方向。

2.4 納米材料修飾酶信號放大技術

該方法是將納米材料同時標記蛋白酶和單克隆抗體，利用蛋白酶催化底物的高效性和產物的顯色性，使得試紙條檢測線顏色加深而實現信號放大的目的[47?49]。目前，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）在ICTS 信號放大技術中應用較為廣泛，其催化效率高，一個酶分子可在1 s 內催化產生103個顏色產物[50]。Parolo 等[51]開發了基于HRP 催化底物的信號放大ICTS，同時研究了三種不同類型的HRP 催化底物3, 3’, 5, 5’-四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）、3, 3’-二氨基聯苯胺鹽酸鹽（diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB）和3-氨基-9-乙 基 咔 唑（3-amino-9-ethyl-carbazole，AEC）對試紙條檢測性能的影響（圖3），結果表明TMB 是HRP 催化底物信號放大技術中理想的物質選擇。Panferov 等[52]則利用堿性磷酸酶實現試紙條的信號放大，用該方法檢測馬鈴薯X 病毒，對其檢測限為0.3 ng/mL，檢測限比常規試紙條降低了27 倍。

圖3 納米材料修飾酶信號放大技術[51]Fig.3 Signal amplification technology by modifying enzyme on nanoparticles[51]

該方法雖然對ICTS 的性能提升效果明顯，信號放大過程簡單（室溫、水溶液、5 min 反應時間），但是蛋白酶相對較差的熱穩定性和化學穩定性是一個潛在的問題，同時酶分子會和抗體競爭地結合在納米材料的表面，導致抗體在納米材料上的結合量減少，酶的空間位阻效應還可能會影響抗體與分析物結合的效率。酶的結合量以及最終信號放大的幅度會受到納米材料有限表面積的限制[53]。

2.5 利用納米催化材料信號放大技術

納米催化材料，也稱為納米酶，是一種基于納米材料的人工酶，其具有和酶相似的催化活性，催化性能受外界環境條件的影響較小，化學性質穩定，易于表面修飾，同時比蛋白酶的生產成本低[54]。利用納米酶催化底物產生的顏色而增強測試線的信號也可實現ICTS 的信號放大。Loynachan 等[55]在15 nm 的納米金顆粒上生長鉑，進而合成多孔的核殼納米催化劑，以該材料作為試紙條的信號標簽（圖4a），對目標物質的檢測限可降低100 倍。Gao 等[56]在金納米材料表面覆蓋鉑層，以形成的納米金@鉑作為信號標記材料，由于鉑的高效過氧化物模擬酶活性，其催化底物顯色使得試紙條的檢測靈敏度提高了兩個數量級，如圖4b 所示。

圖4 應用納米催化材料信號放大技術[55-56]Fig.4 Signal amplification technology by applying nanocatalytic materials[55-56]注：*代表試紙條的檢測限。

近年來應用于ICTS 中的納米催化材料以及使用催化材料之后試紙條的性能提高情況如表4 所示。

表4 在ICTS 中為實現信號放大的目的使用的納米催化材料Table 4 Catalytic nanomaterials used in ICTS for signal amplification purpose

2.6 富集樣品中檢測目標物信號放大技術

近年來富集樣品中檢測目標物的方法主要采用磁性分離技術，因為磁性納米材料合成成本低廉、結構易于控制、具有良好的生物相容性，特別是可以由一塊簡單的磁鐵進行富集操作，使所有的分離過程都在一個離心管中完成，無需耗時的離心過程。在對檢測目標物進行富集時，將抗體偶聯的磁性納米材料添加到樣品基質中，孵育一定時間后，在樣品基質中會形成抗原-抗體-磁性納米材料復合物，然后使用外部磁場的作用提取該復合物，再將分離物重懸到溶液中（磷酸鹽緩沖溶液或去離子水），使用該重懸液進行ICTS 快速檢測分析。因此磁性分離技術除了可以富集檢測目標物以外，還可以將目標物從復雜的樣品基質中分離出來，進而可消除試紙條檢測過程中樣品基質的干擾，提高檢測的靈敏度[64?67]。Zhang 等[27]采用免疫磁分離技術對待檢樣品進行預處理，富集樣品中的待檢目標物，同時消除樣品基質的影響（圖5a）。對鼠傷寒沙門氏菌的檢測限為103CFU/mL。Guo等[29]采用磁分離技術對醬油中的黃曲霉毒素進行分離和富集，同時消除了醬油黑色的樣品基質對ICTS檢測過程中的干擾（圖5b），也可提高檢測的靈敏度。

圖5 富集樣品中檢測目標物信號放大技術[27,29]Fig.5 Signal amplification technology by enriching detection target[27,29]

2.7 降低層析速度法信號放大技術

在ICTS 中，試劑層析的速度相對較快，導致免疫試劑之間的結合時間較短，通過降低液體的流動速度可以提高免疫試劑之間的結合效率，使得試紙條檢測線上結合的信號標簽增多，最終起到ICTS 信號放大的目的。Tsai 等[68]在測試區域和結合墊之間額外增加一個“疊加墊”（圖6），這種設計有助于將抗體和抗原積累在“疊加墊”上進行反應，從而減慢免疫試劑的流動速度，延長抗原/抗體的相互作用時間，提高試驗的檢測靈敏度。與傳統的ICTS 測試相比，該方法可以提高2 倍的檢測信號。

圖6 降低層析速度信號放大技術[68]Fig.6 Signal amplification technology by reducing chromatography speed[68]

近年來通過降低層析速度提高ICTS 靈敏度的方法如表5 所示，同時列出了和傳統的不降低層析速度的方法相比試紙條的性能提高情況。

表5 降低免疫層析速度實現信號放大的ICTS Table 5 Reduce the immunochromatographic speed for signal amplification in ICTS

2.8 非比色法信號放大技術

在傳統的ICTS 中，作為信號標簽的納米材料，其光學特性通常作為信號輸出的基礎，檢測結果采用比色的方法，導致納米材料所具有的出色的光熱傳感能力和表面增強拉曼（Surface-enhanced Raman Spectroscopy，SERS）信號的能力被忽視。研究表明，利用納米材料的熱信號和表面增強拉曼信號對目標物質進行分析，可提高ICTS 的靈敏度[79?85]。

金納米材料在光刺激下通過表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）產生熱，特別是在吸收532 nm 的光時。Zhang 等[86]建立了一種基于金納米材料光熱效應的快速定量試紙條檢測方法，該檢測方法利用激光筆和溫度傳感器用于記錄溫度信號（圖7a），光熱方法對鹽酸克倫特羅和鼠傷寒沙門氏菌的檢測限降低了一個數量級。Zhang 等[33]則建立了基于納米金功能化花狀二氧化錳納米材料光熱效應的ICTS，該方法對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測限為0.013 ng/mL，靈敏度和傳統的基于金納米材料的試紙條相比提高了58 倍（圖7b），同時該方法消除了肉眼在低目標物濃度下無法區分測試條差異的缺點。

圖7 光熱信號放大技術[33,86]Fig.7 Photothermal signal amplification technology[33,86]

SERS 是一種超靈敏的振動光譜技術，具有抗光漂白、響應時間短、波段分辨率高、信息豐富等優點。基于SERS 的免疫層析方法不僅具有SERS 的高靈敏度和光譜分辨的能力，而且具有免疫層析技術的特異性和便捷性。一個典型的SERS 信號標簽由三部分組成：金或者銀納米顆粒作為拉曼增強的基底、吸附在材料上的信號分子用于產生特征拉曼信號、特異性抗體用于識別目標分析物[87?89]。Lin 等[90]通過在金納米星表面吸附4-氨基苯硫酚分子，以其作為試紙條的信號標簽，通過采集試紙條的拉曼信號，對雙酚A 的檢測限為0.073 ng/mL（圖8a），靈敏度是基于比色方法的20 倍。Su 等[91]開發了納米金為核，金納米星為殼的核殼納米材料，拉曼信號分子5,5'-二巰基（2-硝基苯甲酸）位于核殼的中間，以形成的夾心結構的納米材料作為ICTS 拉曼信號標簽（圖8b），對鹽酸克倫特羅進行檢測，對其檢測限為0.05 ng/mL，靈敏度比傳統的基于金納米材料的試紙條提高了200 倍。

圖8 表面增強拉曼信號放大技術[90-91]Fig.8 SERS signal amplification technology[90-91]注：DTNB 代表5,5'-二硫基(2-硝基苯甲酸)。

3 結語

ICTS 經過多年的發展在食品安全快速檢測領域已經占據重要地位，傳統的基于球狀金納米材料的ICTS 檢測靈敏度低，不能滿足食品安全高靈敏檢測的需求。本文總結了近年來ICTS 信號放大技術，盡管使得ICTS 的檢測性能有了極大的提升，但在實際應用過程中仍然存在很多問題。目前存在的主要問題及未來的發展方向簡述如下：a.新型納米標記材料的合成過程相對復雜，耗時耗力，有些材料還需要比較嚴苛的合成條件，同時存在材料穩定性較差的問題，因此，開發合成簡單快速、性質穩定的納米材料仍然是目前研究的一大方向；b.基于增強試劑的信號放大方法需要額外的二次操作以滴加試劑，無疑增加了試紙條的分析時間，因此，開發一步信號放大的方法可極大地提升試紙條的檢測性能；c.基于光熱和拉曼信號的試紙條，需要相應的傳感器，增加了試紙條檢測的成本，開發便攜廉價的傳感器是未來發展的趨勢；d.在試紙條上設置障礙降低免疫試劑的流動速度，雖然可使試劑反應時間增長，提高檢測的靈敏度，但是障礙物在試紙條上的設置比較復雜，使試紙條難以實現大規模生產，因此，亟需開發簡單易行的方法來降低流體層析的速度，使得試紙條的生產簡單化。